2020 Fiscal Year Research-status Report
Biosynthesis of chiral polymer with stereochmical reversion
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19K22069
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
田口 精一 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70216828)
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2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | バイオポリマー / 重合酵素 / 立体化学 / キラリティー / 基質特異性 / 微生物重合 / ポリマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多様な微生物が細胞内に合成蓄積するポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は、熱可塑性の脂肪族ポリマーとして利用されるカーボンニュートラルな資源循環環境材料として期待されている。材料特性を考える上で、光学純度は極めて重要な性質であることは周知である。PHAを構成する160種以上の天然モノマーユニットは、全て「R体」であり、光学純度の極めて高いキラルポリマーであることが特徴である。最も典型的なPHAポリマーであるＰ(3HB)は、3-hydroxybutyrate（3HB）のホモポリマーで、(R)-3HB-CoA（補酵素A）モノマーを前駆体として、重合酵素の触媒作用により重合され、100%eeのＲ体から構成される。
今年度は、ポリマー非生産菌である大腸菌において、S体の3HB-CoAを合成できる生合系の条件最適化を進捗させた。混合ラセミ体の3HB・Naを細胞外から添加し、3HB→3HB-CoAの合成反応を触媒する嫌気性細菌由来プロピオニルCoA転移酵素（PCT）を大腸菌に遺伝子導入した。アセチル-CoAをCoAドナー、添加3HBをアクセプターとした生合成を、P(3HB)のホモポリマー合成の可否によって判断した。重合酵素としては、(R)-3HB-CoAモノマーに反応性の高い水素細菌由来由来のものを使用した。こうして、3HB・Naのラセミ体の外部添加、PCT遺伝子導入、水素細菌由来重合酵素遺伝子の導入、の3つの条件を有する微生物培養系を構築できた。最適条件としては、終濃度2%グルコースを含有するLB培地にて30℃/48時間培養が安定的に作動した。PCTを組換え発現させたサンプルを用いて作製した抗体はインビボで使用可能できることも確認できた。(S)体の3HB-CoAは、(R)体の3HB-CoAと同様に定法に従って化学合成した。機能的に発現させたPCT組換えタンパク質を使用して、両鏡像異性体のモノマー基質に対して相対的反応性比を評価したところ、(R)体の3HB-CoAに対して高い反応性を示したが、微弱ながら(S)体の3HB-CoAに対しても反応性を示すことが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初より想定していた本挑戦的課題の完遂には、５点（ここの判断の基準欄と今後の研究推進方策欄で記述）のチェックポイントがある。昨年度の検討で（１）(R)体の3HBホモポリマーが合成できたことから、少なくと添加したラセミ混合物のうち(R)体の3HBが膜透過し、PCTの触媒作用を介して重合系に組み込まれたことが実証できたことになる。この段階で、(S)体の3HB・Naも同様に膜透過できる可能性が強く示唆された。モノマー前駆体である(S)体の3HB-CoAが、細胞内でPCTのCoA転移反応により3HB・Naから変換される必要がある。今回、その培養系の最適化に加え、（２）作製した抗PCT抗体によるインビボでの利用性も確認できた。その結果、使用した組換え大腸菌株において再現性良く発現が確認できた。次いで、インビトロでのPCTの3HB-CoAの鏡像異性体に対する反応性の評価をモノマー基質の化学合成品を用いて行った。その結果、組換えPCTが微弱ながら(S)体の3HB-CoAに対して反応性を示したことは極めて重要な知見である。すなわち、本酵素の立体化学認識に関して緩慢な性質を有することが、(S)型の3HBポリマーを合成する上での必須の要件であるからである。本来予定していたマイルストーンはクリアし、コロナ禍の状況下とはいえ、重要視していたチェックポイントの確認ができたことから順調に進捗していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
先に述べた、本挑戦的課題を突破するための５点（ここの判断の基準欄と今後の研究計画欄で記述）について検証する。今年度までにクリアした課題(1)～(3)の成果を受けて、後続の課題は以下のように説明される。（３）化学合成した立体化学反転(S)体の3HB-CoAに対する反応性、さらには(R)体の3HB-CoAとの相対的反応性比を評価することができたことから、今後必要な実験として、細胞内で合成される(S)体の3HB-CoAのプール量を測定することである。LC-MSを使用した、CoA体の化合物を細胞からの抽出物を対象として行うことである。本実験は、他機関との共同研究で行う予定である。通常、CoA体が細胞内チオラーゼ活性により分解を受けやすいので、安定的にアッセイできる分析系を立ち上げる必要がある。それ以降の、（４）(S)体の3HB-CoAに対して重合活性を獲得した重合酵素の進化分子工学用のスクリーニング系の確立（進化工学プログラムの構築）と（５）微生物合成できた(S)体の3HBがポリマー鎖への取り込みの確認とポリマーの分析、はパラレルに進行する予定である。ポイントは、完全なる反転ポリマー重合に至らなくとも、(S)-3HBモノマーの取り込み現象を感度良くキャッチすることである。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ禍の影響により、特に旅費の捻出ができなかった。これに関しては、リモート会議でカバーできた。次年度も同様の傾向が続くと予測し、最低限度の移動費以外の予算は、主に遺伝子工学試薬とポリマー分析用試薬に転用して、当該研究に効果的に利活用する。
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