2021 Fiscal Year Research-status Report
Biosynthesis of chiral polymer with stereochmical reversion
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19K22069
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
田口 精一 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70216828)
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2019-06-28 – 2023-03-31
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| Keywords | バイオポリマー / 重合酵素 / 立体化学 / キラリティ ー / 基質特異性 / 微生物重合 / ポリマー材料 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内に合成蓄積する微生物ポリマー（ポリヒドロキシアルカン酸：PHA）は、環境生分解性を有する環境循環材料として認識されている。PHAの材料特性を考える上で、光学純度は極めて重要な要因である。PHAを構成するモノマーユニットは、全て立体「R体」であり、光学純度の極めて高いキラルポリマーであることが特徴である。最も標準的なPHAポリマーであるP(3HB)は、(R)-3HB-CoA（補酵素A）モノマーを前駆体として、重合酵素により合成され、100%eeのＲ体から構成される。
今年度は、細胞内におけるS体 3HB-CoAモノマーの供給フラックスの強化とS体モノマー認識に対する重合能力の開発に注力した。評価系として、市販のラセミ体・3HBモノマーを系外から添加し、3HB→3HB-CoAを触媒するため、外来のCoA転移酵素（PCT）を大腸菌に遺伝子導入し、P(3HB)ホモポリマーの合成の可否を指標に判断した。関連酵素の立体化学認識は、PCTは緩やかで重合酵素は厳密であることは知られている。PCTを組換え発現させたサンプルを用いて作製した抗体はインビボで使用可能できることを今回確認できた。(S)体の3HB-CoAは、(R)体の3HB-CoAと同様に定法に従って化学合成した。機能的に発現させたPCT組換えタンパク質を使用して、両鏡像異性体のモノマー基質に対して相対的反応性比を評価したところ、(R)体の3HB-CoAに対して高い反応性を示したが、微弱ながら(S)体の3HB-CoAに対しても反応性を示すことが判明した。一方、インビトロの重合系にて3HB-CoAの両鏡像異性体に対して、使用した重合酵素の活性試験を行ったところ、本重合反応が代謝上律速になることが示唆された。現在、プレートアッセイで陽性のクローンを取得する体制に入っているが、今までのところ、まだポジティブな結果は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初より想定していた本挑戦的課題の完遂には、５点（ここの判断の基準欄と今後の研究推進方策欄で記述）のチェックポイントがある。すでにこれまでの検討で、(R)体の3HBを添加したラセミ混合物のうち(R)体の3HBが、組換え発現したPCT介して機能的に重合することが実証できた。さらに、(S)体の3HB・Naも同様に膜透過後にモノマー前駆体である(S)体の3HB-CoAへの変換が微量なされ、PCTのS体-3HB・Naに対する微弱反応を見出している。これらは、抗PCT抗体による確認試験によっても、実体的に証拠が得られた。インビトロでのPCTの3HB-CoAの鏡像異性体に対する反応性の評価は、組換えPCTが微弱ながら(S)体の3HB-CoAに対して反応性を示したことは、インビボでの人工代謝経路の作動性を予測する上で有用な情報である。使用した重合酵素の立体認識の厳密さは、インビトロの重合系でも確認され、基質特異性が広い酵素もしくは人工進化実験にて分子育種する必要のあることが改めて明らかとなった。以上のことから、引き続き本計画を進める上で、(S)-3HB-CoAのモノマー供給が微弱（モノマー律速）だと、目的の重合酵素の選抜が困難になることから、回避策として高活性PCTの分子育種を並行して実施する計画を追加で始動してポジティブな結果が得られつつある。また研究の過程で、膜小胞創発という予期しない大きな成果も得られた（特許出願・論文発行・学会発表優秀賞・プレスリリースなど）のは、本研究をしていることのアドバンテージだと考えられる。以上、コロナ禍の状況下とはいえ、重要視していたチェックポイントの確認ができたことから順調かそれ以上に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本挑戦的課題を遂行する上でのチェックポイント５点（参照：判断の基準欄と今後の研究計画欄）に関して見直す。今年度までにクリアした課題(1)～(4)の成果を受けて、後続の課題は以下のように説明される。従来より、本系においてマイナスに作用すると想定される「CoA体の細胞内チオラーゼ活性」の特定と消去については、生物学的情報だけでは多くの候補が見つかり、機能的特定は困難が予想される。地道ながら、活性スクリーニングで絞る手法で愚直に進める予定である。また、今回(S)体モノマーに対して重合能を獲得した重合酵素の進化工学用高感度スクリーニング系の確立（進化工学プログラムの構築）と同時並行的に、PCTの高活性化（律速解除）の必要性が浮上したことから、これも優先的に進める計画に軌道修正する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の状況が継続し、国内外の学会への出張費の捻出がないことが大きな理由となっている。
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