2019 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of gene expression by chemical splicing directed by reversible formation of omega-shaped structure on DNA/RNA
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19K22259
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
井原 敏博 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 教授 (40253489)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝田 陽介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (50632460)
北村 裕介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (80433019)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | オメガ型構造 / 人工的スプライシング / 遺伝子発現制御 / 刺激応答 / 光応答性 / 金属イオン / ステープル核酸 / G4構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、化学合成DNA、あるいは内在性RNAのグローバルな構造を操ってその塩基配列を可逆的にスプライシングする。具体的にはDNAやRNAの配列の一部をつまみ出し、一次構造においては互いに離れた二箇所を直接繋ぎ留めてΩ型の構造を形成することで一部の配列をバイパスした状態をつくる。DNAにおいては、そのバックボーン構造の特定の2箇所に刺激応答部位を化学的に挿入し、光や特定の金属イオンなどの外部刺激によるΩ構造形成により標的とするmRNA等に相補的な新しい塩基配列を与えるような分子設計をする。その後、アンチセンスの作用機序（RNaseHによるmRNAの切断）などを利用して遺伝子発現を制御する。RNAにおいては、最終的にはin vivoでの使用を意識しており、化学修飾をせず天然構造のままの特定のmRNAの構造を制御する。刺激としては、トランスフェクションした修飾DNA、内在性、あるいは細胞内で過剰発現させた比較的短いRNA等を用いて、mRNAの狙った箇所に正確にΩ構造を誘起して翻訳のブロックあるいは読み飛ばしなどを利用して発現産物をコントロールする。申請者ら独自のスキルを活かした、新しい発想に基づく他に類をみない挑戦的な研究提案である。
本研究の着想のモデルは言うまでもなく生物が行なっているスプライシングである。しかし、人工の化学修飾DNAやRNAに意図してΩ型構造を誘起して塩基配列を編集し、その結果として発現制御を誘導しようという発想は申請者の知る限りない。DNAの場合には、導入した非天然の機能分子間の配列をバイパスすることで、RNAの場合には、mRNAにG4構造を誘起して関係する遺伝子発現を制御しようという試みは極めて独自性が高く挑戦的である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNAの系では、光制御型のDNAのΩ構造形成を利用した遺伝子発現制御を目指している。構造の一部としてDNA末端にコンジュゲートした二つのアントラセンが、近傍に配置された状況で光照射をすると高効率で二量化することを申請者自ら既に報告している。このアントラセンをDNA鎖中の離れた位置に導入すると、適当な条件下、光照射によりこれらが二量化することでΩ型の構造が形成することになる。この目的のためにアントラセンを基体とするアミダイト試薬を合成した。アントラセンからDNAの主鎖に連結する置換位置を種々変えた３種類（1,5/2,6/1,8）のアミダイト試薬を合成して、自動合成装置にて二つのアントラセンを主鎖骨格の互いに離れた位置に挿入したDNA、ant2DNAを合成した。LEDランプ（366 nm）を用いて、様々な条件において二量化の検討を行なった。使用したアントラセンの異性体のうち、1,8-置換体の二量化効率が最も優れており、スタッキングした際にもっとも立体障害が少ないと考えられる事実で説明することができる。
RNAの系では、レポーター遺伝子をコードするmRNAを標的として短鎖核酸を刺激とする発現制御を行なった。DNAやRNAはG-rich配列で４重鎖構造（G４構造）を生成し、これが生物化学的に重要な役割を果たしていることが多くの結果から示唆されている。GFPのmRNAの5'-UTRにpre-G4配列を挿入したものを使用した。連続G配列間のループ配列に相補的な短鎖核酸（ステープル核酸）とハイブリダイズすることで特定の構造を形成し、連続G配列間の距離を近付けることでG4構造を誘導することを期待した。実際に、20量体のステープルDNAを添加すると、想定した部位にG4構造が形成し、それによってGFPの発現を抑制できることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ant2DNAに関しては分子内の光二量化反応の速度等に関して詳細に検討する。現在までの基礎的な検討の結果では、DNA末端に修飾していたアントラセンの反応性と比較するとかなり低いようである。まず、リンカー長等の検討を行い、改善を図りたい。改善が見られない場合にはアントラセンの構造に工夫を加える必要がある。反応性の低い要因として、アントラセンがDNAの二本鎖構造にインターカレーションしてしまうことでアントラセン同士の二量化を抑制している可能性がある。これを防ぐには、アントラセン平面の片面を覆うようにアルキル鎖をブリッジして嵩高い構造にすることでインターカレーションできなくすることが有効と考えている。さらに、別の系として金属イオンを刺激とする人工的スプライシングを意図してターピリジンなどのDNA骨格に金属キレーターを導入したDNA、terpy2DNAを合成する。これは申請者が合成に成功してその基礎的検討を既に発表している分子である。金属イオン添加によりΩ構造を誘導し、RNaseHを利用したmicroRNAの切断などが可能か検討していきたい。
RNAの系については、in vitroの実験に成功したので、in cellの実験に移る。細胞中でGFPなどの過剰発現させたレポーター遺伝子に加え内在性の遺伝子の発現を選択的にノックダウンできるかの検討を行う。並行して、in vitroで基礎的実験を行う。これまでは４つ必要な連続G配列が2+2で分断されていたpre-G4配列についてステープル核酸によるG4構造形成を行ってきたが、ここで提案する遺伝子発現抑制原理の一般性を高めるために、1+3、あるいは２種類、３種類のステープル核酸を同時に使用して1+1+2、1+1+1+1のpre-G4配列にG4構造を誘起できるかどうかの検討を行う。
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