2019 Fiscal Year Research-status Report
Innovative method development to screen novel antimicrobial peptides by evolutionary genomics approach
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19K22294
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
重信 秀治 基礎生物学研究所, 新規モデル生物開発センター, 教授 (30399555)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 抗菌ペプチド / 次世代シーケンシング / 共生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、昆虫=微生物共生系に着目した革新的な抗菌ペプチドの探索法を開発する。申請者は、昆虫アブラムシと共生細菌の間の共生の分子機構を解明する研究に従事してきたが、その過程で偶然に、ゲノムが明らかであっても従来の方法では同定が不可能な、新しいタイプの抗菌ペプチド群を発見した。また他の昆虫=細菌共生系にも新規抗菌ペプチドが多数存在する事に気付いた。そこで本研究で昆虫=微生物共生系のトランスクリプトームデータから新規抗菌ペプチドをシステマティックに探索する手法を開発する。昆虫=微生物 共生系を対象とする事により、共生進化のユニークな相互作用が生み出す、新たなタイプの抗菌性分子の発見が期待される。これまでに申請者は、エンドウヒゲナガアブラムシにおいて新規抗菌ペプチドBCRファミリーを見出していたが、今年度は他のアブラムシ種で探索した。最近、複数種のアブラムシのRNAseqデータが公的データベースに登録されてきているため、これらの公的データをダウンロードし、de novo assemblyとBCR類似配列の検索を行った。その結果、調査した全てのアブラムシについてBCR相同遺伝子が見つかったが、そのレパートリーは種によって大きく異なり、配列の進化もとても早いことが明らかになった。これらバイオインフォマティクスで発見されたBCRホモログが抗菌活性を有するかどうか、今後細菌に対する添加実験などで検証する。ホモログ間で配列が大きく異なることから、抗菌活性の強度や抗菌活性スペクトラムが大きく異なるのではないかと考えられる。また、BCRファミリー遺伝子の一つは、真菌に対する抗菌活性を有するかもしれないという予備実験の結果を得た。公的データベースの利用のみならず自ら共生器官のRNAseqデータを産出するため、微小なサンプルからでもRNAseqを行う実験手法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は他のアブラムシでも新規の共生的抗菌ペプチドの候補をバイオインフォマティクスで多数見つけることができた。解析パイプラインもブラッシュアップを進め、セミオートマチックに解析することができるようになった。申請時には想定していなかったが、最近申請者の研究室でアブラムシのゲノム編集技術を確立し、BCR遺伝子のいくつかは変異体を作出することができるようになった。その解析はこれからだが、抗菌ペプチドの抗菌メカニズムの解明に大きく貢献できると期待される。アブラムシの近縁種の解析は当初の計画を上回る進展があった。その一方で、アブラムシ以外の昆虫の解析は、やや難航しており、当初の予定より遅延が見られる。これら予想以上に進展している課題とそうでない課題が混在する状況を勘案し、総合的には概ね順調に進展、と判定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究1) 昆虫共生器官のRNA-seqデータ収集:昨年度確立した微量サンプルからの高感度RNAseqの手法を用いて、いくつかの社会性アブラムシのRNAseqを実施する。他の昆虫については、タバココナジラミ(Portiera細菌と共生)、チャバネアオカメムシ(Pantoea 細菌と共生)などを対象とする。
研究2) RNA-seqデータから抗菌ペプチドを探索するプログラムの開発:RNA-seqデータをde novoアセンブリすることにより発現遺伝子のリファレンスを構築する。そこから抗菌ペプチドを探索するプログラムを開発する。それらは、ORF予測、分泌シグナル予測、配列類似性に基づいた高感度検索（隠れマルコフモデルなど）、配列類似性に依存しない抗菌ペプチド探索（等電点、分子量、アミノ酸残基の出現頻度、2次構造等を特徴量とした機械学習）から構成される。
研究3) 新規抗菌ペプチド候補を合成し抗菌活性を調べる:研究2で予測された抗菌ペプチド候補を合成し、抗菌活性を測定する。ペプチドの合成には3つの方法を考えている:1) 化学合成、2) 大腸菌の発現系、3) 真核細胞(ピキア酵母やバキュロウイルス昆虫細胞)の発現系。ただ、抗菌活性を有すれば発現自体が困難である可能性があるので不溶性の封入体から精製する戦略も検討する。抗菌活性は、培養阻害やKirby-Baue rテストなど定法に則って測定する。活性測定の対象微生物は、まず大腸菌を対象とし、解析系が確立したのちに、その他のプロテオバクテリア(α,β,γ)、グラム陽性菌、真菌へと広げていく。
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