2020 Fiscal Year Research-status Report
細胞認識性エクソソームを用いた臓器線維症に対する革新的治療法の開発
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19K22627
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
稲垣 豊 東海大学, 医学部, 教授 (80193548)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳川 享世 東海大学, 医学部, 助教 (10760291)
赤池 敏宏 公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主席研究員 (30101207) [Withdrawn]
後藤 光昭 公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主任研究員 (80235001) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 肝臓学 / 薬物送達 / エクソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、新たなDDSキャリアーとして注目されているエクソソームの細胞への取り込み効率やサイトゾルへの放出性を向上させるとともに、バイオマテリアル技術を応用してエクソソームに細胞認識性を付加することで、従来の限界を打ち破る創薬の新たな方法論を提案することを目的としている。研究２年度目となる2020年度は、初年度に自ら開発した２種類の薬物送達モニタリング用エクソソームを用いて、以下の知見を得た。
１）ホタル・ルシフェラーゼをエクソソーム内包タンパク質として培養液中に高効率に分泌する発現プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションし、得られたルシフェラーゼ搭載エクソソームをマウス初代肝細胞の培養上清中に添加した。この際、エクソソームの細胞内取り込みとエンドソームからサイトゾルへの移行を促進させる炭酸ナノアパタイトを異なる比率でエクソソームと混合し、肝細胞抽出液のルシフェラーゼアッセイにより、エクソソームと炭酸ナノアパタイトの至適混合比率を決定した。
２）同様に、mCherry とEGFPの連結分子を搭載するモニタリング用エクソソームを肝細胞の培養上清中に添加し、３時間後ならびに６時間後の肝細胞内の蛍光色素の局在を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果、エクソソームと炭酸ナノアパタイトを一定の比率で混合することで、エンドソームからリソゾームに移行して分解される前にサイトゾルへと脱出することが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度に取り込み効率の定量評価に有用なホタル・ルシフェラーゼ搭載エクソソーム、ならびに取り込んだエクソソームのエンドソームからサイトゾルへの放出を確認するためのmCherry/EGFPエクソソームの産生系を確立したのに続いて、エクソソームと炭酸ナノアパタイトを一定の比率で混合することで、エクソソーム自体が有する細胞内取り込み効率の低さや、エクソソーム内包物質のサイトゾル放出性の低さによる効果の減弱といった課題を改善することが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究の最終年度となる2021年度には、これまでに得られた知見をさらに発展させて薬物送達の改善に向けて以下の実験を行う。
１）炭酸ナノアパタイトの効果をin vivoでも確認するため、ルシフェラーゼ搭載エクソソームを炭酸ナノアパタイトと混合した上でマウスの尾静脈から投与し、IVISイメージングシステムと摘出した肝臓抽出液のルシフェラーゼアッセイにより評価を行う。
２）エクソソームに細胞認識性を付加するために、肝細胞が特異的に認識するガラクトース側鎖でエクソソームを修飾し、肝細胞への取り込み効率の向上をin vitroならびにin vivoで評価する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染症の流行により、国際学会への参加・発表が困難となり、国内学会についてもオンラインでの参加を余儀なくされた。このため、学会出張旅費や参加費の使用が大幅に減額となった。
次年度には、新型コロナ感染症の状況を見極めながら、積極的に国内外の学会や論文発表を行い、研究成果の公表と国民への情報発信に努めたい。
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