2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of molecular mechanisms of defective neuromuscular signal transmission as a primary cause of sarcopenia
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19K22802
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
大野 欽司 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (80397455)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | サルコペニア / 廃用性筋萎縮 / 神経筋接合部 / リボタグマウス / 遺伝子発現プロファイル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
サルコペニアにおける神経筋接合部(NMJ)信号伝達障害が近年注目されており、廃用性筋萎縮を含めてNMJ信号伝達障害はこれら筋萎縮病態の一次的な原因である可能性が示されている。サルコペニアモデルマウスの脊髄運動神経細胞(SMN)とNMJ筋終板において、(i) 細胞特異的なリボゾームタンパクRPL22へのHAタグの付加を可能にするRiboTagマウスを用いた網羅的遺伝子発現プロファイリング解析と、(ii) SPPLAT法によるNMJ筋終板のアセチルコリン受容体近傍に発現するタンパクの網羅的質量分析(proximity proteomics解析)を行い、サルコペニアにより発現が変動するSMN分子・筋終板分子を同定し、CRISPR/Cas9によるノックアウトiPS細胞から構築をしたin vitro NMJ、ならびにCRISPR/Cas9によるノックアウトマウスを作成し、サルコペニアにおけるNMJ病態機構を明らかにするとともに新規治療法開発につなげることを目標とした。
令和元年度は細胞特異的なリボゾームタンパクRPL22へのHAタグの付加を可能にするRiboTagマウスを用いた網羅的遺伝子発現プロファイリング解析を行った。骨格筋特異的MCKプロモータ下にCreを発現するMCK-Creを入手した。神経筋接合部特異的ColQ1aプロモータ下にCreを発現するColQ1a-Creを新たに作成した。脊髄前角細胞特異的にVAChTプロモータ下にCreを発現するVAChT-Creを入手した。これら３種類のCreマウスとRiboTagマウスを交配し、骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現を各群３個体のRNA-seq解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞特異的なリボゾームタンパクRPL22へのHAタグの付加を可能にするRiboTagマウスと3種類のCreマウスの交配により骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現プロファイルを予定通り明らかにすることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
老齢マウスにおける骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現プロファイルを明らかにする。令和２年度は、SPPLAT法によるNMJ筋終板のアセチルコリン受容体近傍に発現するタンパクの網羅的質量分析(proximity proteomics解析)のセットアップを開始している。サルコペニアにより発現が変動する脊髄前角細胞分子・筋終板分子の機能解析を行うために、CRISPR/Cas9によるiPS細胞のノックアウト実験系を確立している。同時にiPS細胞から構築をしたin vitro神経筋接合部の評価系を構築する。
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| Causes of Carryover |
RNA-seq解析の低価格下などによりRiboTagマウスを用いた骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現プロファイル解析が予定よりも安価に行うことができた。iPS細胞培養系・筋分化誘導系に当初の予想よりも高価な試薬が必要であることが判明し令和２年度への予算の繰越を行った。
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[Journal Article] Ubiquitination of DNA Damage-Stalled RNAPII Promotes Transcription-Coupled Repair2020
Author(s)
Nakazawa Y, Hara Y, Oka Y, Komine O, van den Heuvel D, Guo C, Daigaku Y, Isono M, He Y, Shimada M, Kato K, Jia N, Hashimoto S, Kotani Y, Miyoshi Y, Tanaka M, Sobue A, Mitsutake N, Suganami T, Masuda A, Ohno K, Nakada S, Mashimo T, Yamanaka K, Luijsterburg MS, Ogi T
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Journal Title
Cell
Volume: 180
Pages: 1228～1244.e24
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Congenital myasthenic syndrome-associated agrin variants affect clustering of acetylcholine receptors in a domain-specific manner2020
Author(s)
Ohkawara B, Shen X-M, Selcen D, Nazim M, Bril V, Tarnopolsky MA, Brady L, Fukami S, Amato AA, Yis U, Ohno K, Engel AG
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Journal Title
JCI Insight
Volume: -
Pages: -
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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