2019 Fiscal Year Research-status Report
Design of beta-barrel type transmembrane protein complex by combination of computational and experimental studies
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19KK0178
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 恵太郎 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (20721690)
松浦 友亮 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (50362653)
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| Project Period (FY) |
2019-10-07 – 2023-03-31
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| Keywords | 膜孔形成毒素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜孔形成毒素は標的細胞の細胞膜に膜孔を形成する．膜孔は原子レベルで正確なナノメートルオーダーの孔（ナノポア）であり、これを利用した分子センサーが開発されている。更なる分子センサーの開発のために、目的に応じたサイズ・形状のナノポアを自在に作成できる技術が必要となる。本研究では、実験と計算科学を併用して膜孔のデザインを実現し、任意の分子特性のナノポアを作り出すことを目指す。本研究では黄色ブドウ球菌の膜孔形成毒素に着目して分子デザインを実施する。黄色ブドウ球菌の膜孔形成毒素は、2種類に分類される。1つはホモ7量体の膜孔を形成するアルファヘモリジン、もう一方は、2種類の異なるポリペプチド（LukF、Hlg2）が4分子ずつ会合してヘテロ8量体の膜孔を形成するガンマヘモリジンである。本研究では、アルファヘモリジンとガンマヘモリジンのドメインを融合させたキメラタンパク質を作製し、その分子特性を評価した。これまでに、10種類以上のキメラタンパク質をデザインし、その発現系を構築した。その結果、多くの変異体が不溶性タンパク質として発現されたため、2019年度は、これらのタンパク質の巻き戻し系を構築した。まず、野生型のLukF、Hlg2を用いて、尿素による変性条件下でのNiアフィニティークロマトグラフィーにより、発現タンパク質を精製し、それを希釈法と段階的透析法にて巻き戻した。いずれの方法でも活性を有する分子を得ることができたが、希釈法の方が活性はたかかった。さらに、構築された巻き戻しの方法を用いて各種変異体を調製し、その活性を評価した。その結果、いくつかの変異体にて活性が確認され、キメラ化した膜孔形成毒素も活性を発現できることがあきらかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜孔形成毒素の巻き戻しの系を構築した。また、アルファヘモリジンのcap/rimドメインにLukF、 Hlg2のステムドメインを融合させた複数のキメラタンパク質を設計し、その大量発現系を構築した。いくつかの変異体については、溶血活性が確認でき、構造的特徴も明らかにできつつあり、順調に研究が順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた有望な変異体タンパク質について、生化学的側面と構造生物学的側面から解析する。具体的には、溶血活性、細胞膜への結合活性、多量体形成活性、他のキメラ分子によるシナジー効果の評価、分光学的解析、立体構造解析を行い、得られる情報を新たな変異体のデザインへと応用する。
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| Causes of Carryover |
2020年3月に共同研究先のアメリカのスタンフォード大を訪問し、ポス博士と研究についてディスカッションを行う計画であったが、COVID-19の影響により延期となったことや、田中研准教授の異動により研究遂行に必要な装置を複数購入する必要が出てきたため、次年度に繰り越しを行った。
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