2021 Fiscal Year Research-status Report
Fluorescent imaging probes for epigenetic enzymes with specialized amino acids
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19KK0197
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
中川 秀彦 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (80281674)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川口 充康 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (10735682)
家田 直弥 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (00642026)
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| Project Period (FY) |
2019-10-07 – 2023-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / エピジェネティクス / イメージング / ケミカルバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エピジェネティック制御は近年大きな注目を集めている遺伝子発現及び細胞制御機構の1つであり、生命維持の基本的機構に関わると共に、多くの疾患に関連することが明らかになりつつある。エピジェネティック制御酵素の活性検出蛍光プローブの開発手法について検討し、各酵素特異的なイメージングプローブを開発するを目標として研究に着手した。
これまでにin vitro蛍光プローブ開発として、エピジェネティック酵素の1種であるSIRTアイソザイムについて、独自蛍光プローブの開発を進めてきた。SIRTはタンパク質リシン側鎖に生じたエピジェネティック修飾の1つであるアセチル化修飾を加水分解しアミノ基に変換する活性を有する酵素として報告されたが、アイソザイムのいくつかは脱アセチル化のみならず、脱アシル化を触媒することが近年報告された。特に長鎖脂肪酸由来のアシル基が結合したリシン側鎖の加水分解を行うことが知られ、アセチル化とアシル化の機能の違いが注目されている。 前年度までに、脱アシル化を蛍光検出するプローブの改良を行い、多様なペプチド配列および蛍光消光団を組み合わせたペプチドプローブライブラリの構築を行なった。これらのプローブはSIRTの各アイソザイムに対して異なる反応性を示し、そのうちの1つはSIRT3に優位な反応性を示すことが判明した。 本年度は、このプローブライブラリからSIRT2に良好な反応性を示すプローブを選択し、化合物ライブラリと組み合わせてスクリーニングを行うことで、SIRT2の脱ミリストリル化を効果的に阻害する阻害剤の同定に成功した。
また本年度は、脱アシル化反応阻害活性を有するペプチド性SIRT2阻害剤(本研究の過程で見出したもの)について、細胞膜透過性を付与する検討を進め環状化戦略が良好に機能することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、これまで開発したプローブについて多様性を志向した改良を行い、複数のペプチド配列と複数の蛍光消光団を組み合わせたプローブライブラリの構築に成功し、これを応用することでSIRT2の脱ミリストイル化阻害剤を見出した。また これまで開発したプローブの構造を参考に見出されたSIRT2阻害ペプチドについて細胞膜透過性に着目して改良を行ない、環状化ペプチドが細胞膜透過性に優れた性質を示すことを見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、今回見出したSIRT2脱ミリストイル化阻害剤をもとに脱アセチル化を阻害せず脱ミリストイル化を阻害する選択的阻害剤への展開を目指す。また今回見 出したSIRT3に特異性の高いプローブを利用してSIRT3活性を細胞系で検出できるようプローブの改良を検討する。 プローブの反応性に基づいて同定したSIRT2阻害ペプチドについては、見出された細胞増殖抑制効果が細胞内SIRT2阻害活性と相関するか、細胞膜透過性はどの程度かについて検証を進める。 さらに、タンパク質性蛍光プローブ分子の開発に向けて、非天然アミノ酸タンパク質発現技術と蛍光団、消光団の導入のためのクリック反応を組み合わせ、蛍光団、消光団、ペプチド側鎖の検討を進める。非天然アミノ酸を用いる検討については海外共同研究者の研究室で研究代表者、研究分担者が実施する。
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| Causes of Carryover |
物品費について細胞膜透過性ペプチドの合成・評価および阻害剤の構造展開に想定以上の検討が必要となった結果、多くの試薬および器具の購入が必要となった一方、当初予定していた研究代表者および研究分担者の海外における研究(海外研究協力者の研究機関での研究)が、ウイルス感染症の蔓延による海外渡航禁止措置により実施できず、その後も先方受け入れ機関への渡航を自粛するよう本学および先方機関からの要請があったため、海外機関における研究で使用する予定であった旅費は使用しなかった。その結果、次年度使用額が生じた。
次年度には本学の渡航禁止措置の状況および先方受け入れ機関の状況を検討しつつ、海外協力研究者と打ち合わせを行い、海外渡航旅費に使用することを想定して研究を推進する。
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