2021 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of regenerative medicine for musculoskeletal system using clinical-grade canine iPS cells
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20H03156
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
枝村 一弥 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (80366624)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 大紀 佐賀大学, 医学部, 助教 (00772683)
塩澤 誠司 久留米大学, 医学部, 准教授 (10447039)
鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40453138)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 再生医療 / 運動器疾患 / iPS細胞 / 間葉系幹細胞 / 犬 / 獣医 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
臨床グレードの犬のiPS細胞の運動器再生医療を確立するために以下の検討を行った。
1) 犬のiPS細胞の樹立効率の向上（枝村、塩澤）：従来まで、ウイルスベクターを用いずにElectroporation法にて犬のiPS細胞の作製を行ってきたが、多くの株を得るためには改善が必要であった。そこで、新たにRNA transfection法を用いて、成犬の皮膚線維芽細胞からiPS細胞の樹立を試みた。その結果、RNA transfection法単独では、犬のiPS細胞は樹立できなかったが、両者を組み合わせることで樹立効率が大幅に向上した。
2) 犬のiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導法の確立（枝村、鳩谷）：犬のiPS細胞から神経堤細胞を経由する手法を用い、間葉系幹細胞への分化誘導を試みた。その結果、プラスチック培養器に接着する線維芽細胞様細胞が得られた。これらの細胞は、CD29、CD44、CD90が陽性、CD34とCD45が陰性であることが明らかになり、骨、軟骨、脂肪への三分化能も有していた。また、間葉系幹細胞への分化能の高いiPS細胞株の特定にも成功した。
3) 犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞の軟骨分化誘導能の検証（枝村）： 前検討で得られた犬iPS細胞由来間葉系幹細胞を、軟骨分化誘導培地を用いてペレット培養法にて3週間培養した。その結果、白い軟骨様細胞塊が得られ、アルシアンブルー染色で青染した。これらの所見から、犬iPS細胞由来間葉系幹細胞は軟骨細胞への分化能を有していることが示された。
4) iPS細胞から靱帯様組織体を作製するための手法の確立（村田）：前年度に続き、ヒトiPS細胞由来間葉系幹細胞およびウサギ脂肪由来幹細胞から靱帯様組織体を作製し、それらの方法の改良を行った。それにより、犬iPS細胞由来間葉系幹細胞を用いた靱帯様組織体を作製するための手法を見出すことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
従来から用いてきた成犬の皮膚から樹立したiPS細胞は、間葉系幹細胞への分化能が低いことが判明し、研究を律速させるためには、新たなiPS細胞株を樹立する必要があった。そのため、研究の進捗が少し遅れたが、分化能のより高い犬のiPS細胞の樹立に成功したため、次年度の研究は問題なく遂行でき、遅れは取り戻せるものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
臨床グレードの犬のiPS細胞を用いた運動器再生医療を確立する目的で、今後は以下の項目の検討を継続的に行う。
1) 犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞の安全性評価（枝村、鳩谷、塩澤）：犬iPS細胞由来間葉系幹細胞を、SCIDマウスの精巣内および静脈内に投与して造腫瘍試験を行う。さらに、犬の関節内に投与した際の安全性を確認する目的で、正常犬の膝関節内にiPS細胞由来間葉系幹細胞を投与し、経時的に血液検査、X線検査、超音波検査、関節鏡検査、CT検査を行って有害事象の有無を確認する。
2) 犬の iPS細胞由来軟骨組織の硬度および特性解析（枝村）：前年度までに確立した手法を用いて、犬の iPS細胞由来間葉系幹細胞から軟骨組織を作製する。得られた軟骨組織の硬度をプロービングセンサーにて計測し、正常な犬の軟骨の硬度と比較する。また、得られた組織の特性を解析する目的で、遺伝子発現、表面マーカー、基質産生能の評価を行う。さらに、病理組織学的検査を行って、正常な犬の軟骨組織と比較する。
3) 三次元細胞積層技術を用いた靱帯様組織体の創生と靱帯設置位置の検討（枝村、村田）：まずは、犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞からなる細胞凝集体を作製する。次いで、剣山のような極細ニードルを有する3Dバイオプリンターを用いた三次元細胞積層技術により、靱帯様組織体の作製を行う。次いで、得られた靱帯様組織体の引っ張り強度を測定して、正常な犬の前十字靱帯との強度を比較する。さらに、病理組織学的検査を行って、正常な犬の前十字靱帯の構造と比較する。最後に、死体犬の膝関節において、前十字靱帯の前内側帯および後外側帯の付着部と同じ位置に作製した靱帯様組織体を設置して、引っ張り強度と膝関節の安定性を評価する。
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