2020 Fiscal Year Research-status Report

レジリンを模倣するハイブリッドポリペプチドの創製と物性解析

Research Project

Project/Area Number	20K05637
Research Institution	National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Principal Investigator	福岡徳馬国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域機能化学研究部門, 主任研究員 (90415737)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	弾性タンパク質 / 人工ポリペプチド / バイオエラストマー / レジリン
Outline of Annual Research Achievements	本研究では昆虫の外骨格を形成する高弾性タンパク質である「レジリン」をモデルとした人工ポリペプチドの創製に取り組んだ。レジリンの代表的な繰り返しアミノ酸配列として知られる、キイロショウジョウバエ由来レジリンのExon Iドメインの配列（GGRPSDSYGAPGGGN：EIと略記）、およびガンビエハマダラカ由来レジリンの配列（AQTPSSQYGAP：Agと略記）に焦点を当て、遺伝子工学的手法を利用して大腸菌発現系により、これらの配列が合計32回繰り返し連結した分子量4万前後の3種類のポリペプチドを得た。生産培養試験の結果、Ag配列を持つポリペプチドの方が生産性が高く、Ag配列が連続して32回繰り返されたポリペプチド（Ag32）が培養液1 L当たり60.3 mgの回収量で得られた。次いでN末端側からAg配列が16回、EI配列が16回繰り返してブロック共重合体状に連結したハイブリッドポリペプチド（AG16+EI16）の回収量は30.5 mg/L、その逆の繰り返し配列を持つポリペプチド（EI16+Ag16）は9.8 mg/Lであった。このように、配列の種類とその順序によりポリペプチドの生産性に大きな差が現れることが分かり、特にN末端側の配列が生産量に大きな影響を与えているものと推測された。なお、これらの目的ポリペプチドはいずれも菌体内に生成した大部分が可溶性ポリペプチドとして得られ、His-Tagタンパク質としてNiアフィニティーカラムで分離・精製・回収できることを確認しており、得られた数値は実際に白色粉末として回収した精製ポリペプチドの乾燥重量である。今年度に確保したポリペプチドを用いて今後は分子構造（アミノ酸配列）の違いによる機能比較を進める予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度は、本研究の中で構造・機能の比較を行うために選抜した3種類のポリペプチドの生産・分離・回収条件の確立、および以降の実験に使用するポリペプチドの量の確保を目標に、研究補助員を雇用して生産培養試験に集中的に取り組んだ。目標である100 mg/L以上の生産収率に届かなかったものの、Ag32ポリペプチドについては安定して高い回収量で繰り返し生産ができることを確認し、一定量のポリペプチドを確保できたことから、当初の計画通り着実に研究が進展している。一方、ハイブリッドポリペプチド（特にEI16+Ag16）は生産収率が伸びず、量の確保に時間を要する結果となった。次年度以降のポリペプチドの機能評価についてはAg32を中心に条件検討等を行い、得られた結果を基にハイブリッドポリペプチドの評価を効率的に行うことで研究を加速させたい。
Strategy for Future Research Activity	今年度に確保したポリペプチドを用いてキャスト法によるフィルムの作製を行い、熱物性の測定や引張試験等に取り組む。さらに酸化還元酵素等を使用してペプチド鎖中に含まれるチロシン残基の酸化カップリング反応を介してハイドロゲルの作製やフィルムの硬化を行い、反応前後の構造変化の追跡にも取り組む。諸物性の解析を進めることで分子構造（アミノ酸配列）の違いによる機能比較を行う。
Causes of Carryover	今年度はポリペプチドの量を確保するための繰り返し生産培養を行うために、研究補助員として派遣職員を雇用する人件費に予算の大部分を充当する計画であった。派遣契約時に確保した予算額と実績額との差額が生じたため、これを次年度以降の消耗品費に充てる予定である。また、コロナ禍の輸送の制約の中で納期未定となり、今年度中の購入を断念した一部消耗品があるため、これらも次年度以降使用することとしている。