2022 Fiscal Year Research-status Report

リガンドの多価結合による分子認識機構を有する生体分子間相互作用の解析手法の確立

Research Project

Project/Area Number	21K12112
Research Institution	Kitasato University
Principal Investigator	能登香北里大学, 一般教育部, 准教授 (20361818)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	分子認識機構 / 糖鎖 / 多価結合 / 分子動力学 / 量子化学計算 / アドヘシン
Outline of Annual Research Achievements	糖鎖は生体内で細胞シグナル伝達や宿主免疫応答調節を担う．本研究では，この認識特異性における機構の解明に向けた新たな解析手法の開発を行っている．令和4年度は，前年度に引き続き，大腸菌の1型線毛の付着因子FimHアドヘシンの糖鎖親和性を対象にした．結合様式が異なる四種類の糖鎖とFimH間の親和性の違いについて，各結晶構造をもとにした分子動力学シミュレーションを行い，そのスナップショット構造におけるFimHと糖鎖間の相互作用エネルギーを量子化学計算により求めた．相互作用エネルギーの大きさは実験的に得られた熱力学的データと定性的に一致した．活性部位に存在するアスパラギン酸と二つのチロシン残基の配座の違いによって相互作用が変化し，重要な役割をすることが明らかになった．これらの結果をまとめ，第60回生物物理学会年会において，招待講演を行った．次にリガンドが多価結合する際の認識特異性を評価するための新たなシミュレーション方法の開発に向けて研究を開始した．二つのFimHがマンノース三糖と結合する結晶構造(pdb ID:6gtv, 6gtw)を出発構造として，MDシミュレーションを行い，複合体構造のダイナミクスや溶媒分布の変化を解析した．また，MDシミュレーションのスナップショット構造におけるFimHと糖鎖間の相互作用エネルギーを量子化学計算により算出した．その結果，解離を防ぐための剪断応力が働く状態では一定時間が経過後も相互作用が強く，立体配座が多少変化しても，糖鎖親和性が保持されることが明らかになり，実験結果を支持するものであった．また，活性部位にあるアスパラギン残基は，FimH―糖鎖多価相互作用においても重要な役割をすることが明らかになった．これらの結果を第41回日本糖質学会年会，日本化学会第103春季年会にて発表した．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の2年目である令和4年度は，当初の研究計画の通り順調に研究が進んだ．研究対象である付着因子FimHアドへシンにおける分子間相互作用ついて，実験結果と合う基礎的な知見を得ることができ，その結果をまとめ，招待講演を行った．また，生体内でのリガンド多価結合への展開に向けて研究を開始し，その結果について学会発表を２回の行った．このため，概ね順調に進展していると考える．
Strategy for Future Research Activity	生体内での糖鎖認識におけるタンパク質と糖鎖間の結合はさほど強くなく，複数の糖鎖のまとまりが「模様」として認識されているという実験結果が報告され，その応用が注目されている．前年度までの研究では，FimHアドヘシンでは，タンパク質が単独で糖鎖に結合する「１対１」構造と，２つのタンパク質が１つの糖鎖に結合する「２対１」構造を対象に，糖鎖―タンパク質間の親和性の特徴を明らかにしてきた．令和5年度は，リガンドが多価結合する際の認識特異性の解明を可能にする新たなシミュレーション方法の開発に向けて，１つのタンパク質が複数の糖鎖を認識する「1対多」の系に研究対象を拡張して研究を進める．腸管出血性大腸菌によって産生される志賀毒素のBサブユニットは，標的細胞表面の複数の糖脂質と特異的に，多価結合することが明らかになっている．志賀毒素五量体の結晶構造（PDB ID: 1bos）は報告されており，単量体あたり３種類の糖鎖と結合している．これを出発構造としてMDシミュレーションを行い，糖鎖の種類や結合する部位の違いによる親和性の違いについて解析する．また，シミュレーションの単位時間刻みのスナップショット構造に対して，溶媒を考慮した量子化学計算を行い，詳細なタンパク質―糖鎖間の相互作用を定量的に見積もる．実験で得られた結合解離定数等と比較し，シミュレーション方法の問題点を確認しながら研究を遂行する．研究結果を国内外の学会で発表すると共に学術雑誌に投稿し，リガンドの多価結合による認識に関する基礎情報を発信する．本研究で開発した手法を用いて，多価結合する複数糖鎖とタンパク質間相互作用の特徴を解析し，親和性実験の結果と比較し，シミュレーション方法の汎用性について検討する．
Causes of Carryover	予算計上していたハイパフォーマンスコンピュータが当初予定していた金額よりも安価で入手できたため，物品費の項目で剰余金となった．今年度は，研究成果を積極的に発表するために国際学会を含む複数の学会に参加する予定である．そのための旅費及び，学術雑誌投稿準備のための英文校正代として使用する予定である．