2014 Fiscal Year Annual Research Report
生物毒素に対する分子認識素子の創製と効果的な除染法の開発
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24310125
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| Research Institution | National Research Institute of Police Science |
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Principal Investigator |
瀬戸 康雄 科学警察研究所, 法科学第三部, 部長 (10154668)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鵜沢 浩隆 独立行政法人産業技術総合研究所, ナノシステム研究部門, 上級主任研究員 (60356566)
大沢 勇久 科学警察研究所, 法科学第三部, 主任研究官 (30370886)
宮口 一 科学警察研究所, 附属鑑定所, 鑑定官 (10370884)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | テロ対策 / 分子認識 / 機器分析 / 生物毒素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分子認識素子の性能評価法として、ゾーンキャピラリー電気泳動法を検討したところ、UV吸収検出感度が低いために解析が不可能であることが判明し、本法採用を断念した。ソフトイオン化質量分析（MS）法に関して、エレクトロスプレーイオン化（ESI）-タンデムMS装置を用いて、SEBと市販抗体混合物を分析したところ、SEBおよび抗体ならびに非共有結合複合体の特徴的な多価イオンピークがクロマト分離され観察された。抗体試料に緩衝液が含有され、ESIを顕著に妨害するために、超小型ジオールシリカゲル濾過カラムでオンライン脱塩前処理を行っている。
表面プラズモン共鳴分析法で、Biacore T-100を用いて、市販抗SEB抗体を固定化したCM3センサーチップにSEBをアプライし、また反対にSEBを固定化したチップに市販抗体をアプライして得られたセンサグラムを解析して、ka（1/Ms）、kd（1/s）（両者からKD（M）が得られる）、Rmax（RU）を求めた。マウスモノクローナル抗体8種、ウサギポリクローナル抗体2種の抗体標品を用いたところ、抗体の種類によりKD値、Rmax値に違いが認められた。3種の抗体において、固定化方式によりKD値、Rmax値に差が認められなかったが、6種の抗体において、抗体を固定化してSEBをアプライした方式が低いKD値、高いRmax値を示した。これは、固定化の立体障害性を示している。解析結果を総合して比較したところ、良好なリガンドの選択が可能となった。
合成糖誘導体をシリカモノリス担体に固定化する検討を行った。シリカモノリス担体表面のカルボン酸に、還元末端側にアミノ基を有する糖誘導体を用い、NHSケミストリー法による糖固定化を行った。縮合剤の存在下、ガラクトース、ラクトース誘導体をマイクロ波照射して固定化した。また、1,3-Dipolar cycloadditionによる糖固定化について、カルボン酸修飾モノリスをアルキン修飾したモノリスに変換し、アジド糖誘導体を導入した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ソフトイオン化質量分析法として、エレクトロスプレーイオン化を採用して検討したが、標品中に存在する塩によりイオン化が妨害され、検出が不可能であった。オンラインゲル濾過前処理法を考案し、標品中の塩の除去が可能となり、よいやく評価法の確立が達成されたところである。
キャピラリー電気泳動法は、感度が低く、現時点で評価法として不適と結論され、開発を断念した。
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| Strategy for Future Research Activity |
分子認識素子の性能評価法として、表面プラズモン共鳴法を確立し、１０種類の市販抗体標品を用いて検討したところ有用性が検証され、抗体ごとにSEB結合力を定量的に評価することが可能となっている。今後、確立したソフトイオン化質量分析法を用いて、市販抗体とSEB混合液の分析を実施し、結合親和性を解析して、表面プラズモン共鳴法での結果と比較検討する。また、有望な抗体標品を選択して除染実験を試みる。
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| Causes of Carryover |
ソフトイオン化質量分析法を用いた非共有結合複合体測定法による抗SEB抗体の評価に係る実験の進行が若干滞った。また、計画していた評価法であるキャピラリー電気泳動法が不適と判断されたためにその実験の実行は不必要となった。よって、キャピラリー電気泳動のための費用、分子認識素子レパートリー群の調製、評価のための費用が本年度中に使用できなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ソフトイオン化質量分析法によるリガンドの評価を重点的に実施し、その結果に基づいて、素子レパートリーの調製を精力的に推進するために必要な試薬、器具類を購入する。
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