2012 Fiscal Year Annual Research Report
RNA分子の細胞内構造プローブ法開発と細胞質スプライシング機構解析
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24310163
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
田中 好幸 東北大学, 大学院・薬学研究科, 准教授 (70333797)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
児嶋 長次郎 大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (50333563)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 生体分子計測 / NMR / 安定同位体標識 / バイオプローブ / 細胞内化学反応 |
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| Research Abstract |
本研究課題では細胞内におけるRNA分子の構造解析、及び、動態解析(代謝過程の経時観測等)を目指している。このような解析を行うためには、観測対象のRNA分子と対象ではない内在性RNA分子を識別する必要がある。これを実現するための戦略として、研究代表者は標的RNA分子を安定同位体標識することを計画している。なお生理活性を有したRNA分子の機能にかかわる配列は全配列中の一部であるため、機能性部位のみを標識することで機能構造解析および代謝過程の経時観測が可能となる。従って、本研究課題においてはRNA分子の特定部位のみを標識する手法の開発から着手した。これまで既に、RNA分子の特定の1残基を標識する手法を開発したが、本手法ではRNA酵素分子(group I intron)を用いている性質上、グアノシンしか標識できない問題点があった。そこで平成24年度は、他の塩基も標識可能な新規標識法を確立することを目指した。具体的には近年報告されたRNA polymeraseのプライマー伸長反応(及び標識NTP)を利用して丸任意の核酸塩基(一塩基～数塩基)を標識する新規の部位特異的RNA標識法を確立することを目指した。
まずRNA polymeraseのプライマー伸長反応による一塩基伸長について検討したところ、A、G、C、Uの全てのヌクレオチドについて一塩基伸長が進むことが判った。また数塩基のプライマー伸長反応についても検討して、当該反応が進むことが示された。なおこれらのプライマー伸長反応により生成した一塩基(部分)標識RNA断片については、残りの3。断片との連結反応を行うことで、mRNA中の機能性RNA配列を一塩基、或は、部分標識することに成功した。
このように、既存の手法ではなし得なかった「RNA分子内の機能性配列の一塩基/部分標識法」の汎用的手法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画では初年度に「RNA分子内の機能性配列の一塩基/部分標識法」を確立することを第一目標として掲げており、本目的を達成することができた。本手法の確立により汎用的な一塩基/部分標識法が可能となり、「RNA分子の構造解析/動態解析」が加速するものと期待される。さらに具体的な解析対象と定めたHACImRNAの機能性配列の性状解析によりヘアピン構造をとる配列が確定し、全ての目標を達成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は上述のHACImRNAの機能性配列を用いて、配列中の保存塩基がなぜ保存されているかを酵素学的な切断実験(保存塩基の置換配列の切断実験)により明らかとしていきたい。またRNA分子の細胞内導入法についても検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
直接経費次年度使用額が"13,669円"となっているが(全額の約0.2%)、ほぼ計画通り使用した後の端数である。平成25年度請求額とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
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