2013 Fiscal Year Research-status Report
先進的リアルタイムイメージング法によるクオラムセンシング阻害剤の作用機序の解析
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25461512
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
狩山 玲子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (40112148)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村上 圭史 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (10335804)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 難治性感染症 / 緑膿菌 / 治療 / クオラムセンシング阻害剤 / リアルタイムイメージング |
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| Research Abstract |
多剤耐性菌に対する新規治療薬の開発は喫緊の課題となっており、細菌クオラムセンシング（QS:細胞密度依存的）機構を阻害するQS阻害剤が注目されている。本研究課題では、先進的リアルタイムイメージング法による実験モデル系と分子生物学的手法を駆使して、QS阻害剤の作用機序解明を目指す。
１）リアルタイムイメージングのための発光性緑膿菌の作製と新規マウス薬効評価系の作製：IVIS Luminaを用いるリアルタイムイメージング法を活用するために、緑膿菌PAO1株由来の各種発光性緑膿菌を作製した。新たに作製した発光性緑膿菌をマウス大腿部感染モデルにおいて評価し、発光性の改良を重ねた。一方で、QS阻害剤と各種抗菌薬との併用効果の検討に有用であると考えられる尿路バイオフィルム感染症モデルの作製に着手した。
２）QS阻害剤による抗菌薬感受性化メカニズムの検討：in vitroで殺菌試験を行い、QS阻害剤の抗菌薬抵抗性に及ぼす影響について検討を行った。その結果、PAO1株に対してQS阻害剤を添加することで、抗菌薬添加後の生存率が抗菌薬のみ添加した場合に比べて大きく低下したことから、QS阻害剤が抗菌薬抵抗性に影響を与えていることが示唆された。
３）プロモーター活性測定用緑膿菌の作製：QS阻害剤添加による緑膿菌遺伝子発現の影響を検討するため、lasB、rhlA遺伝子のプロモーターにGFPを連結したプロモーター活性測定用の菌株を作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成25年度は本研究課題の初年度ということで、主要なin vitro実験およびin vivo実験での予備実験に多くの時間を要した。また、QS阻害剤と各種抗菌薬との併用効果の検討に有用であると考えられる慢性感染症モデルとして、新たに発光性緑膿菌による尿路バイオフィルム感染症モデルの作製に取り組むことにした。この実験モデルの確立を目指して、発光性緑膿菌および実験条件の改良を重ねた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）in vitro実験： QS阻害剤が抗菌薬感受性を増強させるメカニズムについて、更なる検討を行う予定である。具体的には、QS阻害剤がQSを阻害することにより、この作用が発揮されるのか否かを確認する。これまでのプロモーター活性の試験では、まだ予備的な結果ではあるが、QS阻害剤のQS阻害効果はそれほど強くはない可能性が示唆されている。このことから、QS阻害剤はQS以外の部分にも作用している可能性が高いと考えられる。どの遺伝子に影響しているかについては、まず、マイクロアレイでQS阻害剤添加後の遺伝子発現の変化について網羅的な解析を行う予定である。その結果をもとに、重要であると考えられる遺伝子を選択し、リアルタイムPCRにより、それらの遺伝子の経時的な発現変動を解析していく予定である。それらの結果をもとに、QS阻害剤が作用しているkeyとなる遺伝子のノックアウト変異株を作製し、抗菌薬に対する感受性の変化を検討することにより、QS阻害剤の作用機序を明らかにしていく予定である。
２）in vivo実験： 新規マウス薬効評価系である発光性緑膿菌による尿路バイオフィルム感染症モデルを再現性のある実験モデルして確立する。マウス大腿部感染モデルでは、平成25年度に作製した緑膿菌PAO1株由来の各種発光性緑膿菌を用いて、QS阻害剤と各種抗菌薬との併用効果の検討を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度は本研究課題の初年度ということで、主要なin vitro実験およびin vivo実験における予備実験に多くの時間を要したので、予定額を使用しなかった。
繰越額と合わせた平成26年度の直接経費は、消耗品費として、分子生物学実験用試薬類、実験動物（マウス）、フローセル用部品、形態観察用蛍光試薬、細菌培養用培地・シャーレ、ボトル・チューブ・チップ類、その他試薬・器具類などを購入する。また、研究成果発表のための学会や研究会への出張旅費および研究打ち合わせのための旅費に使用する。その他、学内共同実験室の機器利用料金、動物資源部門利用料金への支払いなどにあてる。
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