2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26252057
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
日下部 宜宏 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (30253595)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 昌直 慶應義塾大学, その他の研究科, 助教 (20517693)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 染色体 / 動原体 / クロマチン / 複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず、プロテオミクスの手法を用いた新規キネトコアタンパク質の同定については、既知のカイコ動原体タンパク質複合体を発現する培養細胞を構築した。また、不活性型Cas9 (dCas9) を用いることにより、キネトコアタンパク質をカイコゲノムの任意の位置に局在させる系を作製した。これまで、インナーキネトコアタンパク質として５つ (BmCenp-N, L, I, M, K) 同定しているが、Cenp-Iをノックダウンした時のみ細胞周期が前中期に停止しており紡錘糸チェックポイントとの関連性が予想されたため、紡錘糸チェックポイント因子であるMad1, Mad2, Bub1 (BubR1), Bub3をクローニングし、Cenp-Iとの多重RNAiを行った。その結果、Mad1と同時にノックダウンすると前中期に停止する細胞が減少し一過性ではあるが細胞が増殖したため、Cenp-IとMad1の間には遺伝的相互作用はみられた。しかしながら、Cenp-IとMad1には物理的な相互作用はみられなかった。ヒストン脱アセチル化酵素については、HDAC3とHDAC6をノックダウンすると染色体凝集に異常のある細胞がみられた。
また、染色体複製の制御については、カイコ複製関連遺伝子40種の機能阻害実験を行い、各因子の細胞周期に与える解析を終了した。特に、各種DNAポリメラーゼとクランプローダーについては詳細な解析を行い、いずれも遺伝子欠損は致死効果をもたらすものの、その影響には経時的な相違があることを見出した。
ヒストンアセチル化修飾については、HADCに加え、6種のHAT遺伝子をカイコより同定し、予備的な機能阻害実験を行った。また、これまで解析を行ってきたHADCとは異なるファミリーに属するSirtuin遺伝子についても５遺伝子を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
キネトコアタンパク質の同定については、RNAiを用いた表現型解析により多くの因子の同定に成功している。プロテオミクスの手法を用いた、新規キネトコアタンパク質についても、必要なタグ付きキネトコアタンパク質を安定に向上発現する細胞の樹立に成功しており、準備が整っている。
また、異所的な動原体形成誘導についても、不活性型Cas9 (dCas9) システムの導入により、キネトコアタンパク質をカイコゲノムの任意の位置に局在させる系を作製した。これをカイコ反復配列等にテザリングする事により動原体形成誘導が起こるか否かを解析する実験系が準備できた。
染色体複製の制御については、多くのカイコ複製関連遺伝子の機能阻害実験を終了し、以降、テザリングによる複製開始複合体誘導能の検定の準備が整った。
ヒストンアセチル化修飾については、HADC機能阻害細胞のRNA-Seq解析用のライブラリ作製まで終了しており、順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、昨年度構築した実験系を用いて、新規キネトコアタンパク質の同定を試みる。また、不活性型Cas9とキネトコアタンパク質を融合した形で発現させ、キネトコアタンパク質を異所局在させることでde novoセントロメア形成やその周辺に与える影響を解析する。さらに、Cenp-I機能阻害後、紡錘糸チェックポイントタンパク質の動態を調べることにより、分散型動原体における紡錘糸チェックポイントの活性化について解析する。
染色体複製の制御については、昨年度同定した因子の中から、人工染色体構築に重要な因子、すなわち、単独のタンパク質のテザリングにより複製開始が可能なタンパク質の同定を行う。同時に、人工染色体の骨格となる多機能プラスミドの構築も行う。
ヒストン関連因子の解析については、機能阻害実験において細胞周期に与える影響が大きかったHDAC、HATについて機能阻害細胞のトランスクリプトーム解析を行う。また、パイオニア因子、基本転写因子機能阻害細胞のトランスクリプトーム解析も行う。
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Research Products
(4 results)
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[Presentation] Characterization of silkworm replication related proteins for making an artificial chromosome2015
Author(s)
Masato Hino, Hiroaki Mon, Li Zhu, Mami Yamashita, Kazuma Hirata, Dan Zheng, Jian Xu, Ming-Ming Ji, Daisuke Morokuma, JaeMan Lee, Takahiro Kusakabe
Organizer
The 4th Asia-Pacific Congress of Sericulture and Insect Biotechnology
Place of Presentation
Busan, Korea
Year and Date
2015-04-22 – 2015-04-24
Int'l Joint Research
