動脈硬化性疾患の早期診断を可能にする分子イメージング・リピドーム解析技術の構築

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26253036
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 松浦 栄次 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20181688)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 保田 晋助 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00374231)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: β2－グリコプロテインI （β2GPI） / 変異 β2GPI-DV / 質量顕微鏡 / 血管新生 / 酸化脂質 / 酸化低密度リポタンパク質 (oxLDL) / LC-MS/MS / PET イメージング

Outline of Annual Research Achievements

β2-グリコプロテインI（β2GPI）のNational Center for Biotechnology Information （NCBI）のアミノ酸配列のデータベースを元に、第5ドメイン（DV）のプラスミン非感受性配列を想定し、変異型遺伝子組み換えDVタンパク質3種類を大腸菌により発現させ、精製を始めた。
β2GPIがスカベンジする酸化脂質のプロファイルの構築のため、酸化脂質の検出方法の確立が重要である。我々は、高脂血症マウスのリポタンパク質から、コレステロールとその酸化体である7-ケトコレステロール、およびそれらのエステルや、ヒドロキシル基あるいはカルボキシル基をもつ酸化体等の検出に成功した。さらに、動脈硬化モデル動物であるWHHLウサギの動脈硬化病変部の切片から、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を導入したMALDI-TOF-MSにより上述の酸化脂質を検出および同定し、質量顕微鏡を用いて病変部における各種酸化脂質の分布を明らかにした。また、LC-MS/MSによる当該脂質群の分離、解析条件の検討を開始した。
Intact β2GPI （iβ2GPI)、nicked β2GPI（nβ2GPI） 及びリン脂質結合部位を保護したiβ2GPIをキレート剤で修飾した後、Cu-64により標識し、膵臓がん細胞（CFPAC-1）皮下移植マウスを用いてPET/CT画像解析、および解剖による臓器放射能分布解析を行った。その結果、腫瘍への各β2GPI標識体の集積を確認した。β2GPIによる腫瘍のイメージング診断の可能性およびマイクロキャリアによる治療への応用可能性に一歩近づいた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

β2GPI-DVのプラスミン非感受性配列を想定し、3種類のDV-変異タンパク質を大腸菌により発現させ、精製を始めた。
DVのプラスミンの感受性を確認し、native DVや、β2GPI、nicked β2GPI等と比較しながら、β2GPIの各ドメインにおける生理機能を検討する予定である。
β2GPIがスカベンジする酸化脂質のプロファイルの構築において、鍵を握るとも言える酸化脂質の検出方法が確立された。また、LC-MS/MSによる当該脂質群の分離、解析条件の検討を開始した。今後は、アフィニティカラムによる血中酸化脂質の分画およびその検出を試み、酸化脂質のパネルを作る予定である。

Strategy for Future Research Activity

β2GPIがスカベンジする酸化脂質のプロファイルの構築において、診断ツールの開発には、LC－MS/MSによるメソッドの開発が不可欠である。コレステロール等疎水性が強いもの、リン脂質のような比較的疎水性の弱い物質など、HPLCによる精製および検出は、一つのカラムでは難しく、そのメソッドの開発は、最終目的である血中酸化脂質の直接検出に至るまでの難題であると思われる。アフィニティカラムによる前段階処理を工夫し、血中酸化脂質の簡易検出メソッドをいくつか提案し、最終的には、診断ツールの開発を目指す。