2015 Fiscal Year Annual Research Report
低分子化合物を用いた全ゲノム中のグアニン四重鎖の網羅的探索と特異的安定化
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26282214
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
長澤 和夫 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10247223)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | グアニン四重鎖 / テロメア / トポロジー / Pull-down / ポリオキサゾール / ビオチンプローブ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グアニンが豊富な領域では、DNAの高次構造の１つとして知られるグアニン４重鎖構造が形成される。グアニン４重鎖構造はこれまで、テロメア領域や十数種類の遺伝子プロモーター領域においてその形成が示唆され、転写や複製に関与していることが報告されている。現在グアニン４重鎖は、様々な生命現象を司る鍵因子として捉えられてきている。グアニン豊富な領域では、グアニン四重鎖を形成する可能性があるが、実際に形成可能な配列を探索することはこれまで非常に困難であった。一方我々は、グアニン４重鎖と普遍的に相互作用し当該構造を安定化する低分子化合物を報告した。また本化合物に蛍光基を導入することで、グアニン４重鎖を可視化することに成功し、またこれをDNAマイクロアレイ上のDNA配列からグアニン４重鎖構造を形成する配列の可視化による探索に応用することにも成功している。
本研究では、開発したグアニン４重鎖リガンドを用いてゲノムワイドなグアニン４重鎖形成配列の探索を行うことを計画した。具体的には、グアニン４重鎖リガンドにビオチンを結合したプローブを作成し、これを用いた既知のグアニン４重鎖形成配列のpull-downに成功した。
また、グアニン４重鎖由来の生命現象を制御するには、個々のグアニン４重鎖構造を選択的に安定化するリガンドの開発が必要となる。グアニン４重鎖構造は、大きく３種（アンチパラレル型、パラレル型、ハイブリッド型）に大別されることから、これらの３トポロジーをそれぞれ認識し安定化するリガンドの創製についても検討を行った。具体的には、これまで開発してきた大環状ポリオキサゾール化合物の、オキサゾール環の結合位置を系統的に変化させた新規リガンドを合成し、そのトポロジー選択性について評価を行った。その結果、４－２連続型オキサゾール構造を有するリガンドが、アンチパラレル構造を優先的に安定化することを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）ゲノムワイドなグアニン４重鎖形成配列の探索にむけて、以下の検証実験を実施した。これまでに我々が見いだしたグアニン４重鎖リガンド（大環状ポリオキサゾール化合物）にビオチンを導入したリガンドを合成した。本プローブ化合物は、これまでに単独の既知グアニン４重鎖配列を選択的にpull-downすることを見いだしている。そこで全ゲノムからの探索を目指し、グアニン４重鎖形成配列を含む数種の配列の混合物から、グアニン４重鎖配列のpull-downの検討を行った。その結果、開発したビオチンプローブを用いることで、グアニン４重鎖形成配列のみを選択的にpull-downすることに成功した。本知見により、全ゲノムからグアニン４重鎖配列を同定するための基盤手法を開発することができた。
（２）グアニン４重鎖が形成する三つの各トポロジーを選択的に安定化するためのリガンドを開発することを目的に、オキサゾール環の結合位置を系統的に変化させた新規リガンドを合成した。その結果、オキサゾールが４－２個で結合したリガンドが、アンチパラレル構造に対して優先的に相互作用することを見いだした。また本結果に関してドッキングスタディを行うことで、選択性発現の由来についても考察することができた。これにより、当該目的に対する次年度へ向けた分子設計に関する指針を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）ゲノム中からのグアニン４重鎖形成配列の網羅的探索について
これまでに大環状ポリオオキサゾール化合物にビオチンを結合させたプローブを用いることで、グアニン４重鎖形成配列数種と非形成配列を数種含むモデルDNA配列群から、グアニン４重鎖形成配列のみを選択的にpull-downすることに成功している。本年度は、当該実験を細胞抽出液に適応し、ゲノムからの網羅的探索を検討する。
（２）グアニン４重鎖リガンドを用いたグアニン４重鎖のトポロジーの選択的安定化について
大環状ポリオキサゾール骨格から伸長する側鎖に着目した構造展開を行い、トポロジー選択的なリガンドの開発を計画する。具体的には、伸長する側鎖の本数、位置、長さをそれぞれ経緯等的に変化させたリガンドを合成する。この際、より迅速にリガンド合成を行うために、共通中間体からのクリックケミストリーを活用した多様な構造の迅速合成を計画する。
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| Causes of Carryover |
リガンドとの相互作用能を評価するためのDNAを外注している。当初、多様な配列をもつDNAについて、これらのリガンドに対する安定可能を評価するべく、DNAを注文する予定であったが、リガンドの合成に時間がかかったこともあり、限られたDNA配列での評価に留まった。なお、これらは予備的な知見を得るには十分な成果であるが、より一般性を調べるには引き続き多様な配列を持つDNAの購入が必要であり、これを次年度に使用することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度に計画をしていた、グアニン４重鎖を形成する配列、および非形成配列を有するDNAを購入する。
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[Journal Article] Time-resolved crystal structures of the reaction intermediate of nitrile hydrase reveal a role for the cystein-sulfenic acid ligand as a catalyst nucleophile2015
Author(s)
Yasuaki Yamanaka, Yuki Kato, Koichi Hashimoto, Keisuke Iida, Kazuo Nagasawa, Hiroshi Nakayama, Naoshi Dohmae, Keiichi Noguchi, Takumi Noguchi, Masafumi Yohda, and Masafumi Odaka
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Journal Title
Angew. Chem., Int. Ed.
Volume: 54
Pages: 10763-10767
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Rif1 binds to G-quadruplex and suppresses replication over a long distance2015
Author(s)
Yutaka Kanoh, Seiji Matsumoto, Rino Fukatsu, Naoko Kakusho, Nobuaki Kono, Claire Renard-Guilet, Koji Masuda, Keisuke Iida, Kazuo Nagasawa, Katsuhiko Shirahige, and Hisao Masai
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Journal Title
Nat. Struct. Mol. Biol.
Volume: 22
Pages: 889-897
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] パラウアミンの合成研究2015
Author(s)
岩田真、今岡拓哉、松尾浩喜、長澤和夫
Organizer
第69回有機合成化学協会関東支部シンポジウム
Place of Presentation
横浜国立大学（神奈川県・横浜市）
Year and Date
2015-05-16
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