2017 Fiscal Year Annual Research Report
Imaging biomolecular dynamics verified using fluorogenic probes
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26282215
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堀 雄一郎 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00444563)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | PYPタグ / ハイブリッドプローブ / メチル化DNA / 細胞周期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAのメチル化は、遺伝子発現をエピジェネティックに制御する重要な機構であり、その異常は癌などの疾病を誘発することが知られている。このため、DNAメチル化の解析技術は、生命科学・医学の分野で大きなニーズがある。一方、DNAメチル化の生細胞解析技術は、蛍光蛋白質を用いた手法に限られていた。この手法では、メチル化DNAに結合するMBDと呼ぶ蛋白質を蛍光蛋白質に融合させ、その局在を解析する。しかしながら、メチル化DNAに結合していない蛋白質から蛍光が観測されることが問題であった。この問題を解決すべく、昨年度、生細胞中において、PYPタグラベル化技術を用いてMBDをDNA結合色素でラベル化した合成分子/蛋白質ハイブリッドプローブを開発した。今年度は、このハイブリッドプローブを応用して、メチル化DNAの定量及び細胞周期におけるメチル化DNAの動態を観測した。
ハイブリッドプローブは、遊離状態における蛍光は抑制されていて、メチル化DNAと結合すると蛍光強度を上昇させる。そこで、生細胞中のメチル化DNAをハイブリッドプローブにより定量解析できるかを検証した。まず、異なる濃度のDNAメチル化阻害剤で細胞を処理し、細胞を破砕し、メチル化DNAの量を抗体をベースにした市販のキットで定量した。この結果と、ハイブリッドプローブを用いたイメージングから得られた蛍光強度のデータを比較すると、良好な相関が見られた。以上のことから、ハイブリッドプローブは、イメージングによるメチル化DNAの定量を可能にしたといえる。また、蛍光蛋白質プローブとの比較をしたところ、蛍光蛋白質プローブは、DNAメチル化阻害剤処理にもかかわらず、核内から蛍光が観測された。このことから、ハイブリッドプローブの優位性が証明された。更に、ハイブリッドプローブにより細胞周期中のメチル化DNAの観測に成功した。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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