2015 Fiscal Year Annual Research Report
ヘテロクロマチン構造の確立と維持を制御する分子機構
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26291072
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
中山 潤一 名古屋市立大学, システム自然科学研究科, 教授 (60373338)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / 発現制御 / ヘテロクロマチン / 分裂酵母 / ユビキチン化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物の染色体機能に必須なヘテロクロマチン形成の分子メカニズムの解明を目指して、本年度は以下の２つの項目の研究を遂行した。
【研究項目１：CLRC複合体の機能解析】分裂酵母のヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4、Raf1、Raf2とともにCLRC複合体を形成しており、ユビキチン化との関連が示唆されているがその詳細は不明である。昨年度までに精製したCLRC複合体を用いたin vitroユビキチン化アッセイによって、ヒストンH3がユビキチン化の標的になることを見出した。本年度はこの知見をもとに標的となる残基の特定を目指した。まず、質量分析によってユビキチン化されたヒストンH3を調べることで、H3のN末端の複数の標的リジン残基を同定した。次に、候補となるリジン残基に変異を入れた基質を用いてユビキチン化アッセイを行ったところ、14番目のリジンに変異を導入した場合に、CLRCのユビキチン化活性が顕著に減少することを見出した。
【研究項目２：ヒストンH3のユビキチン化動態の解析】これまで分裂酵母の細胞内でヒストンH3がユビキチン化修飾を受けているという報告はなかったが、上記の解析結果から、ヒストンH3のユビキチン化がヘテロクロマチン形成において重要な役割を果たしている可能性が考えられた。そこで分裂酵母の細胞内のユビキチン化状態を解析するため、ユークロマチンのマーク（H3K4me2）とヘテロクロマチンのマーク（H3K9me2）を認識する抗体を用いてクロマチンを免疫沈降し、そのサンプルを質量分析を用いてユビキチン化の解析した。その結果、H3K9me2に対する抗体で沈降したクロマチンに、H3K14のユビキチン化が特異的に検出されることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでCLRC複合体の役割や基質については全く明らかにされておらず、その活性を検出するとともに、実際に標的となる基質と残基を特定したのは大きな成果であり、ヘテロクロマチン形成とユビキチン化との関係解明につながる画期的な成果であると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでのin vitroの研究から、CLRC複合体によってヒストンH3の特定の残基がユビキチン化されることが明らかになった。今後はユビキチン化修飾がどのようにヒストンのメチル化修飾を制御するのか、メチル化とユビキチン化の関係に注目して研究を進める予定である。また、細胞内のどのような生理的条件下でユビキチン化が起きるのか、特に細胞周期との関係を解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
当初計上した予算のうち、物品費、旅費、人件費の支出が当初の予定よりも少なくなった。旅費については、本研究提案に関して発表した国内学会の多くが招待講演であっため、旅費の支出がなかったのが理由である。物品費と謝金については、当初雇用予定であった研究員・テクニシャンの雇用で適任者がいなかったため、その分の謝金と実験に関わる物品費に差額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は新しい研究員・テクニシャンを雇用する予定であり、その分の謝金、物品費に費用がかかると見込まれる。また本年度はこれまでの研究成果をまとめて専門誌への投稿を考えており、そのための費用に充てる予定である。
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