2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26292109
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (90425421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 亨 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (30221972)
足立 伸次 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (40231930)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ティラピア / 性分化 / アロマターゼ / 濾胞刺激ホルモン / gsdf |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）濾胞刺激ホルモン（FSH）の卵巣分化誘導または精巣分化抑制に対する関与：１）FSH受容体（fshr）プロモーター下流にレポーターを組み込んだベクターを遺伝的雌（XX）に導入した。レポーターの発現を調べることでfshr発現細胞を特定することが期待される。２）HEK293浮遊細胞系を利用して機能的ティラピア組換えFSHを作製した。今後作製予定のfshrトランスジェニックXYティラピアにin vivoで投与することでアロマターゼ（cyp19a1a）の発現が誘導されるか、または、分泌因子gsdfの発現が抑制されるかどうかの結論が得られる。
（２）gsdfの精巣分化誘導機構：１）CMVならびにAGプロモーターを利用したgsdf強制発現系－XXトランスジェニック魚を作製し、精巣分化が誘導されることを明らかにした。gsdfが精巣分化誘導に十分な因子であることを証明した。２）HEK293浮遊細胞系を利用して機能的ティラピア組換えgsdfを作製した。これをXX仔魚腹腔に投与することで、dmrt1発現が誘導されるか、また、雌性ホルモン（E2）産生が抑制されるのかを明らかにする。同時に、gsdfによって影響を受ける遺伝子発現を調べることができる。
（３）XY仔魚への低濃度E2投与による遺伝子発現の変化：孵化後4－10日目の間300ng/mlのE2でXY仔魚を暴露した場合、gsdf遺伝子発現は高まらないものの、dmrt1遺伝子発現は一旦上昇した後遅れて減少することを示した。この結果は、通常XX雌ではE2がdmrt1ではなくgsdfの発現抑制を通して精巣分化を抑制していることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）FSHの卵巣分化誘導機構の解析では、レポーター遺伝子を利用したfshr発現細胞を調べるトランスジェニック魚の準備が整った。また、機能的ティラピア組換えFSHが作製され、FSHの卵巣分化誘導に対する役割を調べるための準備を整えた。
（２）gsdfの精巣分化誘導の解析では、gsdfが精巣分化誘導に対して十分な因子であることを示した。また、機能的ティラピア組換えgsdfが作製され、その精巣分化誘導メカニズムを調べるための準備を整えた。
（３）XYティラピア低濃度E2処理によって、gsdfとdmrt1のmRNA発現変化の時間差を明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
ティラピア生殖腺の性分化開始分子機構の解明を目的に、卵巣分化誘導についてはFSH、cyp19a1a発現、E2産生の関係に、精巣分化誘導についてはgsdfとdmrt1の関係、精巣分化抑制についてはfshrとgsdf、ならびにE2とgsdfまたはdmrt1の関係に焦点を当てて研究を進める。また、超雄偽雌を作製することでティラピア養殖における安定的全雄生産システムを確立する。
（１）濾胞刺激ホルモン（FSH）の卵巣分化誘導または精巣分化抑制に対する関与：１）fshrプロモータートランスジェニック魚におけるレポーター遺伝子の発現細胞を調べ、XX未分化生殖腺におけるfshr発現細胞を特定する。同時に、in situ hybridization法でfshr発現細胞の特定を試みる。２）CMVプロモーター下にfshrを組み込んだベクターを構築し、fshr強制発現系トランスジェニックXYティラピアを作製する。３）機能性組換えFSHを精製し、精巣培養系でその活性を確認する。４）fshrノックアウトXXティラピアを作製する。
（２）gsdfの精巣分化誘導機構：１）機能性組換えgsdfを精製する。それをXXティラピア仔魚に顕微注射し、dmrt1およびcyp19a1a発現の変化を調べるとともに、その未分化生殖腺を収集する。未分化XX生殖腺を組換えgsdfと供に培養し、形態形成へ与える影響を調べる。２）gsdfノックアウトXYティラピアを作製する。
（３）XY仔魚への低濃度E2投与による遺伝子発現の変化：さらに低濃度のE2処理をXY仔魚に施し、その性分化へ与える影響と、性分化関連遺伝子の発現変化を調べる。特に、gsdfとdmrt1遺伝子の発現変化の時間的差とステロイド合成酵素群の発現変化に与える影響を明らかにする。
（４）開発したY判別DNAマーカーを利用し、YY雌（超雄偽雌）を作製する。
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