2014 Fiscal Year Annual Research Report
ATP放出性マキシアニオンチャネルの分子同定と心筋虚血・再灌流障害への役割解明
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26293045
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| Research Institution | The Graduate University for Advanced Studies |
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Principal Investigator |
岡田 泰伸 総合研究大学院大学, その他部局等, 学長 (10025661)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 俊昭 生理学研究所, 大学共同利用機関等の部局等, 准教授 (00373283)
松浦 博 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60238962)
沼田 かお理(佐藤かお理) 生理学研究所, 大学共同利用機関等の部局等, 研究員 (60614196) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アニオンチャネル / 心臓 / ATP放出 / 虚血・再灌流 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの細胞は、種々のストレス下において細胞外にATPを放出するが、その経路としてはエキソサイトシス性のものとチャネル性のものがあることが知られている。私達は、後者チャネルとしてマキシアニオンチャネル（Maxi-Cl）が、心筋細胞を含めて多くの細胞系において、関与することを示して来た。更に最近、乳腺腫瘍由来株C127細胞におけるATP放出性Maxi-Cl分子として、♯4819.5遺伝子産物タンパク質を同定した。そこで本研究では、心臓の虚血・再灌流負荷時におけるATP放出についても同様にこの分子が関与することを明らかにすることを第1の目的とし、その放出ATPの病態生理学的役割を解明することを第2の目的とする。平成26年度においては、成熟マウスより摘出した心臓のランゲンドルフ標本において、脱酸素・脱グルコース液の灌流による「虚血」と、その後の酸素・グルコース再投与による「再灌流」のモデル実験を行い、「再灌流」時に限局してATP放出が、再現性よく見られることを確認した。また、この「虚血・再灌流」性ATP放出は、繰り返し行うと次第に減弱することを見出した。次に、マウスにあらかじめマウス尾静脈より、3日間連続して♯4819.5にたいするsiRNAを投与（テスト）、あるいはそのコントロールとしてスクランブルsiRNAを投与（コントロール）し、4日目にその摘出心臓に対してRT-PCRを行ったところ、テスト心臓におい♯4819.5遺伝子の発現が有意に減少していることを確認した。また、4日目にランゲンドルフ虚血・再灌流実験を行ったところ、4819.5遺伝子サイレンシングされたテスト心臓からのATP放出が有意に抑制されることを見出した。これらの結果を英文原著論文にまとめて、国際誌へ投稿した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウスのイン・ビボ遺伝子サイレンシングの実験条件の設定に、かなりの日数を要した上に、更にはランゲンドルフ摘出心「虚血・再灌流」実験とその灌流液ATP測定そのものに長時間を要し、1日2～3匹の実験しかできず、例数をかせぐためにもかなりの月日を要した。そのため、イン・ビトロの培養心筋細胞実験まで手がまわらず、それに関しては課題研究年度内の後半以降の実施となるものと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
論文投稿の結果、更に多くの追加実験（下記）がレフェリー査読によって求められたので、今後の実験の最優先事項として、これらを行うこととし、培養心筋細胞実験は更に研究期間内で後まわしにせざるをえなくなった。即ち、①本遺伝子のCRISPRノックアウトによる培養乳腺腫瘍細胞Maxi-Clチャネル活性消失の確認と、②摘出心ATP放出へのパネキシンチャネルの寄与の排除の追加実験である。その上で、この「虚血・再灌流」性摘出心ATP放出の病態生理学的意義の検討のための実験を行うこととする。
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| Causes of Carryover |
物品費についてはH26に計画していたイン・ビトロ実験が次年度以降に延期されたためであり、旅費については国内出張の必要回数が増えたために当初予定していた海外出張をとりやめて次年度以降にも必要な頻回の研究打合わせ国内出張費に備えたためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費については次年度以降に行うイン・ビトロ実験および放出ATP病態生理学実験において必要な多種薬品の購入にあて、旅費については次年度以降も頻回に必要となる岡崎や滋賀の共同研究者との研究打合わせ国内出張のための費用にあてる。
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