Elucidation of global metabolic control mechanisms by microRNA-33a/b and development of specific regulatory strategy using artificial nucleic acid

• Project/Area Number: 17H04177
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Cardiovascular medicine
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 尾野 亘 京都大学, 医学研究科, 准教授 (00359275)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀江 貴裕 京都大学, 医学研究科, 助教 (20565577)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000); Fiscal Year 2019: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2018: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2017: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
• Keywords: マイクロRNA / 代謝 / 核酸医薬 / iPSC / 人工核酸

Outline of Annual Research Achievements

①miR-33a/bを改変したiPS細胞の解析
これまでに、miR-33aとmiR-33bは標的遺伝子に違いがあるとの報告があり、それぞれが別の作用を持っている可能性がある。CRISPR-Cas9システムを用いて、miR-33a/bのそれぞれ、あるいは両方が無いヒトiPS細胞を作成した。その結果、新たに遺伝性痙性対麻痺（Hereditary Spastic Paraplegia; HSP）SPG4の原因遺伝子であるSPASTがmiR-33の標的遺伝子であることが明らかとなった。実際にSPG4の患者より樹立されたiPS細胞から神経細胞を誘導し、合成RNAオリゴヌクレオチドでmiR-33aを抑制したところ、SPASTから作られるタンパク（SPASTIN）が増加し、SPG4による神経細胞軸索の短縮が改善した。すなわち、SPG4に対して、miR-33aを抑制する合成核酸が新たな疾患治療薬として用いられる可能性がある。
②miR-33a/bコンディショナルKOマウスの表現型解析
miR-33aとmiR-33bのコピー数の解析においては、肝臓ではmiR-33bがmiR-33aの10倍程度発現しており、miR-33bの影響が大きいと考えられる。また、マクロファージではこれらは同等である。そこで、臓器別のmiR-33a/bの役割の違いについて、臓器特異的遺伝子改変マウスを作成した。miR-33aflox/floxおよびmiR-33bflox/floxノックインマウスとAlbumin-Creマウス、LysM-Creマウスの交配を開始し、現在その表現型を解析中である。
③miR-33a/bによる個体レベルでの新たな恒常性維持機構の解析および④ miR-33a/b特異的人工核酸の生体での効果解析
AAVウイルスを用いた標的遺伝子の生体での解析を行い、人工核酸の投与による効果を検討中である。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

①これまでに、miR-33aとmiR-33bは標的遺伝子に違いがあるとの報告があり、それぞれが別の作用を持っている可能性がある。CRISPR-Cas9システムを用いて、miR-33a/bのそれぞれ、あるいは両方が無いヒトiPS細胞を作成した。その結果、新たに遺伝性痙性対麻痺（Hereditary Spastic Paraplegia; HSP）SPG4の原因遺伝子であるSPASTがmiR-33の標的遺伝子であることが明らかとなった。実際にSPG4の患者より樹立されたiPS細胞から神経細胞を誘導し、合成RNAオリゴヌクレオチドでmiR-33aを抑制したところ、SPASTから作られるタンパク（SPASTIN）が増加し、SPG４による神経細胞軸索の短縮が改善した。すなわち、SPG4に対して、miR-33aを抑制する合成核酸が新たな疾患治療薬として用いられる可能性がある。上記内容についてすでに特許申請中である。
②miR-33a/bコンディショナルKOマウスの表現型解析については正常食での臓器特異的KOマウスの解析がほぼ終了し、現在論文を作成中である。
③miR-33a/bによる個体レベルでの新たな恒常性維持機構の解析については、個体レベルでの新たな恒常性維持機構の解析を行うために、ペンシルベニア大学から、AAVウイルスベクターを導入し、標的遺伝子の生体での解析を開始した。予定していたより、詳細な機能解析につなげることができると考えられる。
④ miR-33a/b特異的人工核酸の生体での効果解析については、miR-33aおよびmiR-33bのそれぞれを個別に抑制できる人工核酸の効果を検討中である。すでに容量反応試験は完了している。さらに疾患モデルでの検討を続ける。

Strategy for Future Research Activity

①miR-33a/bが司る、細胞、臓器、個体レベルの代謝調節機構の解明については、脂質ラフトの解析とラフトに存在する受容体の機能の変化を、miR-33a-/-およびmiR-33bノックインマウスの初代培養細胞、変異iPS細胞を用いて検討する。
②miR-33aflox/floxマウス、miR-33bflox/floxノックインマウスを用いた臓器ごとの表現型解析については、それぞれの臓器特異的miR-33aおよびmiR-33b欠損マウスに高脂肪食負荷、高コレステロール負荷を行い、コントロールマウスと比較検討する。さらに脂肪組織においてもmiR-33bの発現は高く、特異的な作用を及ぼしている可能性がある。
③miR-33a/bによる個体レベルでの新たな恒常性維持機構の解析については、さらにmiR-33aflox/floxマウスと各種-Creマウスを交配し、表現型を検討する。一方、miR-33bノックインマウスでは、欠損マウスと逆の表現型を呈するため、miR-33a/b欠損の表現型との比較に用いる。また、AAVウイルスベクターを用いて、miR-33a/b標的遺伝子の生体での役割の解析を行う。
④miR-33a/b特異的人工核酸の生体での効果解析とドラッグデリバリーシステム（Drug delivery system; DDS）の検討については、病態モデルへの投与効果を検討するとともに、全身投与による副作用の有無について検討を行う。核酸の投与は、まず皮下注射によって全身投与し、その効果を検討する。その後に、必要なDDSについて検討を開始する。

Research Products

• [Journal Article] Impact of Baseline Thrombocytopenia on Bleeding and Mortality after Percutaneous Coronary Intervention (2018)
  • Author(s): Ito Shinya、Watanabe Hirotoshi、Morimoto Takeshi、Yoshikawa Yusuke、Shiomi Hiroki、Shizuta Satoshi、Ono Koh、Yamaji Kyohei、Soga Yoshimitsu、Hyodo Makoto、Shirai Shinichi、Ando Kenji、Horiuchi Hisanori、Kimura Takeshi
  • Journal Title: Am J Cardiol. Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.amjcard.2018.02.010
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Long Non-Coding RNAs as Key Regulators of Cardiovascular Diseases (2018)
  • Author(s): Ono K, Kuwabara Y, Horie T, Kimura T.
  • Journal Title: Circ J Volume: 印刷中 Issue: 5 Pages: 1231-1236
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-18-0169
  • NAID: 130006725985
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Prognostic impacto of left ventricular ejection fraction in patients with severe aortic stenosis (2018)
  • Author(s): Taniguchi T, Morimoto T, Shiomi H, Ando K, Kanamori N, Murata K, Kitai T, Kadota K, Izumi C, Nakatsuma K, Sasa T, Watanabe H, Kuwabara Y, Makiyama T, Ono K, Shizuta S, Kato T, Saito N, Minatoya K, Kimura T; CURRENT AS Registry Investigators.
  • Journal Title: JACC Cardiovascular Interv Volume: 11 Pages: 145-157
  • DOI: 10.1016/j.jcin.2017.08.036
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Therapeutic angiogenesis by local sustained release of microRNA-126 using poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles in murine hindlimb ischemia (2018)
  • Author(s): Tsumaru S, Masumoto H, Minakata K, Izuhara M, Yamazaki K, Ikeda T, Ono K, Sakata R, Minatoya K.
  • Journal Title: J Vasc Surg Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.jvs.2017.08.097
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Single-session versus staged procedures for elective multivessel percutaneous coronary intervention. (2018)
  • Author(s): Toyota T, Morimoto T, Shiomi H, Yamaji K, Ando K, Ono K, Shizuta S, Saito N, Kato T, Kaji S, Furukawa Y, Nakagawa Y, Kadota K, Horie M, Kimura T,
  • Journal Title: Heart (British Cardiac Society) Volume: Nov 16.
  • DOI: 10.1136/heartjnl-2017-312117
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Smoking cessation reduces the lectin-like low-density lipoprotein receptor index, an independent cardiovascular risk marker of vascular inflammation. (2018)
  • Author(s): Komiyama Maki、Wada Hiromichi、Ono Koh、Yamakage Hajime、Satoh-Asahara Noriko、Shimada Sayaka、Akao Masaharu、Morimoto Tatsuya、Shimatsu Akira、Takahashi Yuko、Sawamura Tatsuya、Hasegawa Koji
  • Journal Title: Heart Vessels. Volume: 33 Pages: 9-16
  • DOI: 10.1007/s00380-017-1026-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Preclinical evaluation of a paclitaxel-incorporated nanoparticle-coated balloon in rabbit and porcine models. (2017)
  • Author(s): Yamamoto E, Watanabe S, Bao B, Watanabe H, Nakatsuma K, Izuhara M, Ono K, Nakazawa G, Kimura T, Saito N.
  • Journal Title: Cardiovasc Revasc Med. Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.carrev.2017.10.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impact of Transient or Persistent Contrast-induced Nephropathy on Long-term Mortality After Elective Percutaneous Coronary Intervention. (2017)
  • Author(s): Abe M, Morimoto T, Nakagawa Y, Furukawa Y, Ono K, Kato T, Kadota K, Ando K, Ishii M, Masunaga N, Akao M, Kimura T.
  • Journal Title: Am J Cardiol. Volume: Dec 15;120(12): Pages: 2146-2153
  • DOI: 10.1016/j.amjcard.2017.08.036
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Very long-term clinical outcomes after radiofrequency catheter ablation for atrial fibrillation: A large single-center experience. (2017)
  • Author(s): Kawaji T, Shizuta S, Morimoto T, Aizawa T, Yamagami S, Yoshizawa T, Ota C, Onishi N, Sasaki Y, Yahata M, Nakai K, Hayano M, Nakao T, Hanazawa K, Goto K, Doi T, Ono K, Kimura T.
  • Journal Title: Int J Cardiol. Volume: 249 Pages: 204-213
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2017.09.023
• [Journal Article] Genetic Ablation of MicroRNA-33 Attenuates Inflammation and Abdominal Aortic Aneurysm Formation via Several Anti-Inflammatory Pathways (2017)
  • Author(s): Nakao T, Horie T, Baba O, Nishiga M, Nishino T, Izuhara M, Kuwabara Y, Nishi H, Usami S, Nakazeki F, Ide Y, Koyama S, Kimura M, Sowa N, Ohno S, Aoki H, Hasegawa K, Sakamoto K, Minatoya K, Kimura T, Ono K.
  • Journal Title: Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology Volume: 37 Pages: 2161-2170
  • DOI: 10.1161/atvbaha.117.309768
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Imbalanced expression of polycistronic miRNA in acute myeloid leukemia (2017)
  • Author(s): Kotaki R, Higuchi H, Ogiya D, Katahira Y, Kurosaki N, Yukihira N, Ogata J, Yamamoto H, Mohamad Alba S, Azhim A, Kitajima T, Inoue S, Morishita K, Ono K, Koyama-Nasu R, Kotani A.
  • Journal Title: International Journal of Hematology Volume: 106 Pages: 811-819
  • DOI: 10.1007/s12185-017-2314-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Nardilysin is a promising biomarker for the early diagnosis of acute coronary syndrome. (2017)
  • Author(s): Chen Po-Min、Ohno Mikiko、Hiwasa Takaki、Nishi Kiyoto、Saijo Sayaka、Sakamoto Jiro、Morita Yusuke、Matsuda Shintaro、Watanabe Shin、Kuwabara Yasuhide、Ono Koh、Imai Masao、Inoue Katsumi、Murai Tatsuya、Inada Tsukasa、Tanaka Masaru、Kita Toru、Kimura Takeshi、Nishi Eiichiro
  • Journal Title: Int J Cardiol. Volume: 243 Pages: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2017.04.047
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transradial versus transfemoral approach in patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-elevation acute myocardial infarction: insight from the CREDO-Kyoto AMI registry. (2017)
  • Author(s): Yamashita Y, Shiomi H, Morimoto T, Yaku H, Kaji S, Furukawa Y, Nakagawa Y, Ando K, Kadota K, Abe M, Akao M, Nagao K, Shizuta S, Ono K, Kimura T
  • Journal Title: Heart Vessels. Volume: 32 Pages: 1936-1944
  • DOI: 10.1007/s00380-017-1021-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Asymptomatic Lower Extremity Deep Vein Thrombosis ― Clinical Characteristics, Management Strategies, and Long-Term Outcomes ― (2017)
  • Author(s): Yamashita Y, Shiomi H, Morimoto T, Yoneda T, Yamada C, Makiyama T, Kato T, Saito N, Shizuta S, Ono K, Kimura T.
  • Journal Title: Circ J Volume: 81 Issue: 12 Pages: 1936-1944
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-17-0445
  • NAID: 130006219233
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of a Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cell Model for the Investigation of <i>SCN5A</i>-D1275N-Related Cardiac Sodium Channelopathy (2017)
  • Author(s): Hayano M, Makiyama T
  • Journal Title: Circ J Volume: 81 Issue: 12 Pages: 1783-1791
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-17-0064
  • NAID: 130006219109
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dynamic changes of serum microRNA-122-5p through therapeutic courses indicates amelioration of acute liver injury accompanied by acute cardiac decompensation (2017)
  • Author(s): Satoshi Koyama, Takashi Kuragaichi, Yukihito Sato, Yasuhide Kuwabara, Shunsuke Usami, Takahiro Horie, Osamu Baba, Daihiko Hakuno, Yasuhiro Nakashima, Tomohiro Nishino, Masataka Nishiga, Tetsushi Nakao, Hidenori Arai, Takeshi Kimura, Koh Ono
  • Journal Title: ESC Heart Fail. Volume: 4 Pages: 112-121
  • DOI: 10.1002/ehf2.12123
  • NAID: 120006318903
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Significant association of RNF213 p.R4810K, a moyamoya susceptibility variant, with coronary artery disease. (2017)
  • Author(s): Morimoto T, Mineharu Y, Ono K, Nakatochi M, Ichihara S, Kabata R, Takagi Y, Cao Y, Zhao L, Kobayashi H, Harada K. H, Takenaka K, Funaki T, Yokota M, Matsubara T, Yamamoto K, Izawa H, Kimura T, Miyamoto S, Koizumi A
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 12
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0175649
  • NAID: 120006309308
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Incidence and Prognostic Impact of Heart Failure Hospitalization During Follow-Up After Primary Percutaneous Coronary Intervention in ST-Segment Elevation Myocardial Infarction (2017)
  • Author(s): Taniguchi T, Horie M, et al.
  • Journal Title: Am J Cardiol. Volume: 印刷中 Pages: 1729-1739
  • DOI: 10.1016/j.amjcard.2017.03.013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prevention of neointimal formation using miRNA-126-containing nanoparticle-conjugated stents in a rabbit model. (2017)
  • Author(s): Izuhara M, Kuwabara Y, Saito N, Yamamoto E, Hakuno D, Nakashima Y, Horie T, Baba O, Nishiga M, Nakao T, Nishino T, Nakazeki F, Ide Y, Kimura M, Kimura T, Ono K.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 12(3)
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0172798
  • NAID: 120005997927
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cardiac and Noncardiac Causes of Long-Term Mortality in ST-Segment-Elevation Acute Myocardial Infarction Patients Who Underwent Primary Percutaneous Coronary Intervention. (2017)
  • Author(s): Yamashita Y, Shiomi H, Morimoto T, Yaku H, Furukawa Y, Nakagawa Y, Ando K, Kadota K, Abe M, Nagao K, Shizuta S, Ono K, Kimura T; CREDO-Kyoto AMI Registry Investigators.
  • Journal Title: Circ Cardiovasc Qual Outcomes. Volume: 10
  • DOI: 10.1161/circoutcomes.116.002790
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MicroRNA-33 Controls Adaptive Fibrotic Response in the Remodeling Heart by Preserving Lipid Raft CholesterolNovelty and Significance (2017)
  • Author(s): Nishiga M, Horie T, Kuwabara Y, Nagao K, Baba O, Nakao T, Nishino T, Hakuno D, Nakashima Y, Nishi H, Nakazeki F, Ide Y, Koyama S, Kimura M, Hanada R, Nakamura T, Inada T, Hasegawa K, Conway SJ, Kita T, Kimura T, Ono K.
  • Journal Title: Circ Res Volume: - Pages: 835-847
  • DOI: 10.1161/circresaha.116.309528
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Novel Long Intergenic Noncoding RNA, Lionheart, Guards the Heart from Pressure Overload (2018)
  • Author(s): Kuwabara Y, Horie T, Baba O, Nishiga M, Nakao M, Nishino T, Nakazeki F, Koyama S, Kimura T, Ono K.
  • Organizer: 第82回日本循環器学会
• [Presentation] MicroRNA-33b promotes atherosclerotic plaque formation in Apoe-/- mice (2018)
  • Author(s): Nishino T, Horie T, Baba O, Kuwabara Y, Hakuno D, Nakashima Y, Nakao T, Nishiga M, Kimura T, Ono K.
  • Organizer: 第82回日本循環器学会
• [Presentation] Roles of microRNAs in cardiovascular diseases (2017)
  • Author(s): Koh Ono
  • Organizer: 2nd International Symposium for Noncoding RNA Neo-taxonomy In conjunction with Tokyo RNA Club 23rd meeting
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] MicroRNA-33b promotes atherosclerotic plaque formation in Apoe-/- mice. (2017)
  • Author(s): Koh Ono
  • Organizer: 43rd Naito Conference Noncoding RNA
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] MicroRNA-33b promotes atherosclerotic plaque formation in Apoe-/- mice. (2017)
  • Author(s): Nishino T, Horie T, Kuwabara Y, Nakao T, Nishiga M, Ide Y, Nakazeki F, Koyama S, Kimura M, Kimura T, Ono K
  • Organizer: American Heart Association Scientific Sessions 2017
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 心血管疾患分子機構解明グループ
  • URL: http://kyoto-u-cardio.jp/kisokenkyu/metabolic/
• [Patent(Industrial Property Rights)] miR-33bノックインマウスによる非アルコール性脂肪肝炎モデル (2018)
  • Inventor(s): 尾野 亘、堀江貴裕、西野共達
  • Industrial Property Rights Holder: 尾野 亘、堀江貴裕、西野共達
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2018
  • Application Year: 2018
  • Overseas