Establishment of subcutaneous pancreatic islet transplantation method using new material (Recombinant Peptide) ; for the clinical application of subcutaneous islet transplantation.

Research Project

Project/Area Number	18K16272
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	植松智海東北大学, 医学系研究科, 非常勤講師 (30811476)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2018: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	皮下膵島移植 / Fibroblast Growth Factor / I型コラーゲン様リコンビナントペプチド / 血管新生細胞外マトリックス（ECM） / ADSCｓ / 膵島移植 / 皮下移植 / Recombinant Peptide / Extracellular Matrix
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、重症１型糖尿病の根治療法において、リスクが高い従来の経門脈的膵島移植に代わる低侵襲な皮下膵島移植の開発である。我々はｂFGF（basic fibroblast growth factor）を使用したデバイスを作成し、皮下膵島移植の生着率向上に血管新生の重要性を示した。さらに我々は新規素材であるI型Collagen様リコンビナントペプチド（富士フイルムrecombinant peptide（商品名Cellnest）：以下RCP）を用いて安全で効果的な皮下血管床構築法を確立することにより、従来の経門脈移植と同等の皮下膵島移植の生着率向上を実現した。同研究室では、皮下にRCPを適用することで移植膵島の生着促進効果により得られる糖尿病治癒効果が、臨床膵島移植の標準移植法である経門脈移植と比べてどの程度の位置づけであるのかを検証し、RCPの移植前皮下留置による皮下膵島移植法が膵島移植の新しい移植方法となる可能性を示した（稲垣明子、後藤昌史　他）。本研究では、マウスを用いてRCP皮下デバイスにおける皮下膵島移植時の血管新生の評価を目的とし、RCP皮下デバイスを留置後摘出し（短期間または長期間留置）、同種同系膵島を移植、血管新生の免疫染色による半定量分析を行い、以前血管新生により皮下の膵島生着に有用であったと考えられるbFGFデバイス群と比較した。しかし、予測に反し、対照群、ｂFGF群、短期RCP群、長期RCP群について免疫染色による新生血管の評価を行ったところ、膵島内の新生血管は、短期RCP群、長期RCP群共にコントロール群と有意な差を認めなかった。このため二光子顕微鏡を用いてより詳細な血管新生機序を求める計画は変更し、RCP皮下デバイスの膵島生着には、血管新生以外の要素が重要であると考え、膵島移植時の生着率向上に関与すると考えられるECMを同定することを目的とした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason これまで、Heparan sulfateが膵島機能の活性化に必要不可欠であることや（Ziolkowski 他）、Ⅳ型Collagenによる膵島機能の回復（Yap 他）、LamininやFibronectinが膵島機能を維持させるのに極めて重要であることが報告されていること、また、膵島分離作業中に、膵島周囲のECMが破壊され、それにより膵島の機能が損なわれることなども報告されていることから、現在膵島生着に必要と考えられるECMの同定を試みた。上記と同様に、マウスにRCP皮下デバイスを留置後に膵島移植を行い、免疫染色で膵島周囲のECM （Laminin、Fibronectin、Vitronectin、Collagen Ⅳ）の存在を半定量化で確認した。この結果、Lamininに関しては明らかな有意差を認めず、Fibronectinに関してはbFGF群とRCP長期留置群において有意に発現が高く、Vitronectinに関しては、bFGF群の発現が有意に高く、かつRCP長期留置群が高い傾向を示し、Collagen Ⅳに関してはbFGF群が有意に高い発現を示した。Heparan sulfateに関しては、現在統計中である。
Strategy for Future Research Activity	以上より、RCP単体では血管新生において有意な差を認めるには至らなかったが、移植部位の間質組織におけるFibronectinの発現増強傾向が認められたことから、RCPに血管新生作用を有する脂肪組織由来幹細胞(Adipose-derived stem cells: 以下ADSCs)を付加した群（以後RCP＋ADSCs群）とRCP単独群の検証を実施した。この結果、血糖推移と治癒率ではRCP単独群、RCP＋ADSCs群で有意な差は認めなかったが、膵島機能を示す腹腔内ブドウ糖負荷試験ではRCP＋ADSCs群が有意に良好であった。また、各群での膵島内部における新生血管を免疫染色による半定量化で比較したところ、RCP＋ADSCs群における新生血管はRCP単独群と比較し多い傾向にあった。以上より、各群の間質組織のFibronectinと、移植膵島グラフトの被膜におけるCollagen IIIの発現を確認したところ、RCP＋ADSCs群の有意な増強を認めた。また移植膵島の被膜に関してはLamininおよびCollagen IVに関しても発現が増強する傾向が確認された。これらの結果から、RCP＋ADSCs群では膵島内部における新生血管増強効果と移植部位および膵島グラフトの被膜におけるECMのup-regulationが相乗的に作用し移植成績向上をもたらしたと考えられる。