グルタチオン代謝を担う古典的酵素の新規機能：破骨細胞活性化の構造基盤
| Project/Area Number |
18J22606
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Structural biochemistry
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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| Research Fellow |
高尾 春奈 宮崎大学, 医学獣医学総合研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Keywords | レドックスバランス / 構造生物学 / グルタチオン代謝 / ジスルフィド結合 / 破骨細胞活性化因子 / 骨粗鬆症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）は、グルタチオン（GSH）分解を介して酸化的ストレスから細胞を保護する「酵素」であると信じられてきた。一方で最近、GGTは破骨細胞活性化因子であるという驚くべき事実が報告され、骨粗鬆症の原因の一つであることが分かってきた。本研究では、GGT本来の生理学的意義を明らかにすることをゴールとし、酵素活性と破骨細胞の新規活性化因子としての機能という独立した2つの分子機能の解明を目的としている。
GGTは二つのサブユニット（L-およびS-subunit）から構成されるヘテロダイマー構造を持ち、この構造が大きく変化する可能性を予想している。そこで、分子表面のCys50-Cys74およびCys192-Cys196のジスルフィド結合が構造変化に関係しているのではないかと考え、変異導入と精製を試みた。しかし、前段階のhGGTのHis-tagによる精製が難航している。
さらに、ロイシンリッチモジュール構造を持つTLR4細胞外ドメインおよびその補因子MD-2を得るために、昆虫細胞（High-Five）を用いた発現・精製系の構築を試みた。Bac-to-Bacバキュロウイルスシステムによって、ヒト由来TLR4とMD-2遺伝子を細胞内に導入した。SDS-PAGEや銀染色、吸光度を用いたサンプル発現の評価を行い、MD-2は精製標品を得ることができた。しかし、TLR4の発現の有無は評価できなかった。現在、大腸菌を用いたTLR4とMD-2の発現・精製系を構築している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は、hGGTの分子表面に存在するCys50-Cys74およびCys192-Cys196のCys残基に変異を導入することを計画していた。まず、変異を導入することでGSH活性が落ちてしまうため、hGGT wild-typeのHis-tagによる発現・精製を試みた。昆虫細胞系（バキュロウイルス系）による発現においては、His-tagが糖鎖に埋もれて精製できない可能性が示唆された。そこで、hGGTからHis-tagまで100残基付与して発現系を構築した。タグ付きのhGGTは、GSH分解活性を有していることがわかったが、予定していたhGGTのHis-tagによる精製ができておらず難航している。
また、昆虫細胞（High-Five）によるBac-to-Bacバキュロウイルスシステムを用いたヒト由来TLR4とMD-2の発現・精製系の構築を試みた。MD-2は問題なく発現・精製することができ、培地150 mLから0.2 mg/mL得られた。しかし、TLR4は発現系を組むことすら難しい状況である。そこで現在、大腸菌を用いてヒト由来TLR4とMD-2の大量発現系を構築している。
さらにhGGTの基質認識機構を探索するために、基質フリーのサンプルを用いた基質結合アナログ型阻害剤のソーキングおよび共結晶化のスクリーニングを進めていった。約1200条件のスクリーニングの中から構造解析可能なデータこそ得られていないものの、現在、新しい結晶化条件で結晶が析出している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、hGGTのHis-tagによる精製が難航しているため、タグを変えて再度発現・精製系を構築し、Cys残基に変異を導入したhGGTを得る。
ヒト由来TLR4およびMD-2は、大腸菌を用いて発現させる。TLR4とMD-2の発現・精製に成功した際、hGGTとの相互作用を見極める。予想しているhGGTの構造変化を検出するために、サーマルシフト法・Native-PAGEおよび動的光散乱法による解析を進めていく。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
