Master the genome-editing technology in birds
| Project/Area Number |
19K22286
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
堀内 浩幸 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 教授 (80243608)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / ニワトリ / ノックイン / 始原生殖細胞 / PITCh法 |
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| Outline of Research at the Start |
鳥類であるニワトリのゲノム編集は，標的となる1細胞期受精卵の取扱いかが困難なため，他の生物種に比べて遅れていた。実施者は，標的細胞に始原生殖細胞（PGC）を選択し，この培養方法を新たに開発した。その結果，ゲノム編集による遺伝子ノックアウトニワトリの作出に成功した。しかし，ゲノム編集のもう一つの利点であるノックイン技術は，従来の相同遺伝子組換えでは低効率のため成功例が少ない。そこで本研究では，広島大学で開発されたゲノム編集技術を活用した高効率ノックイン法であるPITCh法をさらに改変し，鶏卵中に有用タンパク質を効率よく蓄積させる新たな手法を構築する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）ニワトリオボアルブミンの開始コドンと終止コドンを標的としたTALEN-PITchベクターを構築し，SSA assay並びにCel-1 assayにより標的領域を切断することを確認した。またノックイン遺伝子として抗体遺伝子ではなく，再生医療の材料として必須でかつ多量に必要なヒト線維芽細胞増殖因子（FGF2）に変更し，ノックインベクターを構築した。
２）これに先駆けて，ヒトFGF2の導入領域を特定し，in vitroでの活性試験から，ノックインベクターに分泌用シグナル配列の付加は不要であることを突き止めた。
３）ニワトリにおけるゲノム編集の標的細胞である始原生殖細胞（PGC）の培養方法の改変に成功した。これにより，将来応用展開を図る際に障壁となるゲノム編集ツールの特許を回避できる可能性が出てきた。すなわちノックインを，ゲノム編集ツールを使わずに細胞内で自然に起こる相同遺伝子組換え（HR）を利用する手法である。そこで，HR用のベクターを作製した。
４）作出したPITchベクターとHRベクターを用いて，PGCへのノックインを行なった。
５）オボアルブミンの遺伝子座に有用タンパク質遺伝子をノックインする際に，N末側に連結するかC末側に連結するか，最終的な鶏卵で発現量に影響がでることが予想される。そこでこれをin vitroで事前に確認できるように，オボアルブミン分泌細胞を開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ベクターの作製からPGCへのノックインまで順調に進展している。また当初の予定以外にも，PGCの培養方法の改変，HR法の導入，オボアルブミン分泌細胞の樹立など今後問題となり得る部分の対処も初年度に実施できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）ヒトFGF2をノックインしたPGCをクローニングし，初期胚への移植から生殖細胞キメラニワトリ（G0）を作出する。G0が性成熟した段階から，野生型との交配により，G1個体を作出する。
２）オボアルブミン分泌細胞に対して，N末連結型もしくはC末連結型ノックイン細胞を樹立し，発現効率を比較する。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
