心臓再生医療に向けた３次元組織培養法の開発

• Project/Area Number: 19K23607
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: 0403:Biomedical engineering and related fields
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 松田 祐典 岡山大学, 大学病院, 医員 (90845752)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: iPS細胞 / 再生医療 / 心筋

Outline of Research at the Start

先行研究において2次元培養でのiPS細胞とヒト由来の歯肉線維芽細胞と共培養した心筋組織の作成に成功した。この結果をもとに、生体へ臓器を移植するためのステップとして、より巨大な組織の作成が必要と考えられた。本研究では異種動物由来材料の非存在下でiPS細胞を3次元的環境下にて分化誘導し、立体的な心筋組織を作成する。本研究の成果は、虚血性心疾患患者に対するドナー心臓不足の解消につながることが期待される。

Outline of Annual Research Achievements

成熟した心筋組織の作成を目的に、ヒト由来のiPS細胞とヒト歯肉線維芽細胞を共培養させ、心筋細胞へ分化誘導させる過程に培養細胞伸展システムによるストレッチ刺激を加えた。
作成した心筋組織に対して、遺伝子レベルでの分化度の評価のためqPCRを行った。心筋細胞関連マーカーとしてNkx2.5、cTnT、多能性マーカーとしてSox2、Oct4を使用した。ストレッチ刺激を与えた組織(以下ストレッチ群)は対照群と比較して有意に心筋関連マーカーが増加した。一方で、ストレッチ群の多能性マーカーは統計学的に有意でないものの、対照群と比較して減少傾向にあった。
また、タンパク質レベルでの評価のために免疫染色を行った。心筋細胞関連マーカーとしてcTnT、MYL2を使用した。これらのタンパク質の発現はストレッチ群、対照群の両方で著明であり、いずれもサルコメア構造が認められた。cTnTの発現は比較的広い領域で観察されたが、MYL2の発現はストレッチ群と対照群の両方でまばらであった。組織の配列について、ストレッチ群では伸展方向と平行な心筋組織の配列が観察されたが、対照群では明らかではなかった。
組織の微細構造の形態学的比較のため電子顕微鏡を用いて観察を行った。対照群のサルコメア構造と比較して、ストレッチ群のサルコメア構造は有意に大きいことが分かった。
以上の研究結果より、ストレッチ刺激はiPS細胞の心筋細胞への分化の成熟に影響を及ぼす可能性があることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

先行研究においてヒト由来のiPS細胞とヒト歯肉線維芽細胞を共培養させることで、より成熟した心筋組織を作成することに成功したが、本研究によって得られた研究成果により、その心筋組織をさらに発展させられる可能性が示唆された。3次元培養の前段階である2次元培養においてこれらの知見が得られた意義は極めて大きく、本研究の大目的である成熟した心筋組織を作成することへ着実に前進していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

予備実験として最適な培養条件を検討した後に、ヒト由来のiPS細胞とヒト歯肉線維芽細胞を、ゲルを用いて3次元にて共培養させる。心筋組織の作成後、遺伝子レベル、タンパク質レベルでの分化度の評価のためqPCR、免疫染色を行う。収縮力の評価のため動画撮影を行い、分析・評価する。また、Caイメージングによる電気的興奮性の評価も行う。
3次元での心筋組織の培養が確立された後、3次元培養における心筋組織に対するストレッチ刺激の分化への影響を評価する。