迅速で高感度なNMR解析によるin situ構造生命科学

• 研究課題/領域番号: 21H02419
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分43020:構造生物化学関連
• 研究機関: 東京都立大学
• 研究代表者: 伊藤 隆 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (80261147)
• 研究分担者: 美川 務 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 専任研究員 (20321820)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円); 2023年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2022年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2021年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
• キーワード: In-cell NMR / 蛋白質 / 立体構造 / ダイナミクス / 相互作用 / 液液相分離 / in-cell NMR / 分子クラウディング

研究開始時の研究の概要

細胞内の分子クラウディング環境は，蛋白質の活性，立体構造やダイナミクスに影響を与える．生細胞中の生体高分子を原子分解能で直接観測するin-cell NMRを用いて，細胞内蛋白質動態の詳細な理解を目指す．
本研究ではまずin-cell NMRの要素技術の高度化を行う．実証研究としては，モデル試料に加えてMAPK経路の蛋白質群を用いる．In-cell NMR解析で得られた立体構造，ダイナミクス，蛋白質間相互作用などを解析することで，細胞内分子クラウディング環境の普遍的な理解に挑戦する．

研究成果の概要

(1)細胞内蛋白質の立体構造・ダイナミクスの解析，(2) 細胞内マルチドメイン蛋白質のドメイン間相互作用の解析，(3) 細胞内蛋白質間相互作用の解析，について研究を行った．
(1)については，「迅速で高感度な多次元NMR測定法」，「情報科学を駆使した自動NMRデータ解析と高精度自動立体構造解析法」，「細胞試料を長時間測定するためのマイクロ培養技術」などの要素技術の開発を行った．(2)については，常磁性NMR情報を用いることで，linear-polyUbなどの試料についてドメイン間相対配置の決定を行った．(3)については，Nrf2とKeap1の相互作用のヒト細胞内での解析などで成果が出た．

研究成果の学術的意義や社会的意義

本研究の成果によって，これまで困難であった，「細胞内環境が，様々な生命現象に関与する蛋白質群の立体構造やダイナミクスに与える影響」の詳細な解析が，in-cell NMRの手法を用いて可能になりつつある．細胞内クラウディング環境は生体高分子が内在的に持つ生物活性上重要な性質を顕在化させている可能性があり，単離精製された状態に加えて，細胞内での蛋白質動態の研究が加速すれば，蛋白質の生物活性発現のより良い理解につながる．また，本研究の成果は，例えばヒト培養細胞内の原子分解能でのドラッグスクリーニングなど，医療や創薬への波及効果も大いに期待される．

研究成果

• [国際共同研究] University of Cambridge/University of Leicester(英国)
• [国際共同研究] Goethe University Frankfurt(ドイツ)
• [国際共同研究] ETH Zurich(スイス)
• [国際共同研究] University of Cambridge/University of Leicester(英国)
• [国際共同研究] Goethe University Frankfurt(ドイツ)
• [国際共同研究] ETH Zurich(スイス)
• [国際共同研究] University of Cambridge/University of Leicester(英国)
• [国際共同研究] Goethe University Frankfurt(ドイツ)
• [国際共同研究] ETH Zurich(スイス)
• [雑誌論文] Direct Observation of Membrane-Associated H-Ras in the Native Cellular Environment by In-Cell ¹⁹F-NMR Spectroscopy (2023)
  • 著者名/発表者名: Ikari Masaomi、Yagi Hiromasa、Kasai Takuma、Inomata Kohsuke、Ito Masahiro、Higuchi Kae、Matsuda Natsuko、Ito Yutaka、Kigawa Takanori
  • 雑誌名: JACS Au 巻: 3 号: 6 ページ: 1658-1669
  • DOI: 10.1021/jacsau.3c00108
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural insights into the complex of oncogenic KRas4BG12V and Rgl2, a RalA/B activator (2023)
  • 著者名/発表者名: M. Tariq, T. Ikeya, N. Togashi, L. Fairall, S. Kamei, S. Mayooramurugan, L.R. Abbott, A. Hasan, C. Bueno-Alejo, S. Sukegawa, B. Romartinez-Alonso, M.A.M. Campillo, A.J. Hudson, Y. Ito, J.W.R. Schwabe, C. Dominguez, K. Tanaka
  • 雑誌名: Life Sci. Alliance 巻: 7 号: 1 ページ: e202302080-e202302080
  • DOI: 10.26508/lsa.202302080
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Interactions of the N- and C-Terminal SH3 Domains of Drosophila Drk with the Proline-Rich Peptides from Sos and Dos (2023)
  • 著者名/発表者名: P.M. Sayeesh, M. Iguchi, Y. Suemoto, J. Inoue, K. Inomata, T. Ikeya, Y. Ito
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Sci. 巻: 24 号: 18 ページ: 14135-14135
  • DOI: 10.3390/ijms241814135
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Activation of oxidoreductases by the formation of enzyme assembly (2023)
  • 著者名/発表者名: Ura Tomoto、Sakakibara Nanako、Hirano Yu、Tamada Taro、Takakusagi Yoichi、Shiraki Kentaro、Mikawa Tsutomu
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 13 号: 1 ページ: 14381-14381
  • DOI: 10.1038/s41598-023-41789-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Transient formation of multi-phase droplets caused by the addition of a folded protein into complex coacervates with an oppositely charged surface relative to the protein (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakakibara Nanako、Ura Tomoto、Mikawa Tsutomu、Sugai Hiroka、Shiraki Kentaro
  • 雑誌名: Soft Matter 巻: 19 号: 25 ページ: 4642-4650
  • DOI: 10.1039/d2sm01422j
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural and biochemical insights into heterotetramer formation of oncogenic K-Ras4BG12V and Rgl2, a RalA/B activator (2023)
  • 著者名/発表者名: 02.Tariq, M., Ikeya, T., Togashi, N., Fairall, L., Bueno-Alejo, C., Kamei, S., Romartinez-Alonso, B., Campillo, M.A.M., Hudson, A. J., Ito, Y., Schwabe, J.W.R., Dominguez, C. & Tanaka, K.
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: 1 ページ: 1-56
  • DOI: 10.1101/2022.10.10.511529
  • オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Activation of L-lactate oxidase by the formation of enzyme assemblies through liquid?liquid phase separation (2023)
  • 著者名/発表者名: Tomoto Ura, Ako Kagawa, Nanako Sakakibara, Hiromasa Yagi, Naoya Tochio, Takanori Kigawa, Kentaro Shiraki, Tsutomu Mikawa
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 13 号: 1 ページ: 1435-1435
  • DOI: 10.1038/s41598-023-28040-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Insight into the C-terminal SH3 domain mediated binding of Drosophila Drk to Sos and Dos (2022)
  • 著者名/発表者名: Sayeesh P.M., Ikeya, T., Sugasawa, H., Watanabe, R., Mishima, M., Inomata, K., & Ito, Y.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 625 ページ: 87-93
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.08.007
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] SARS-CoV-2感染機序についての構造生物学的研究の現状 (2021)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 隆
  • 雑誌名: エアロゾル研究 巻: 36 号: 4 ページ: 237-245
  • DOI: 10.11203/jar.36.237
  • NAID: 130008132519
  • ISSN: 0912-2834, 1881-543X
  • 年月日: 2021-12-20
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural basis of the protochromic green/red photocycle of the chromatic acclimation sensor RcaE (2021)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Nagae, Masashi Unno, Taiki Koizumi, Yohei Miyanoiri, Tomotsumi Fujisawa, Kento Masui, Takanari Kamo, Kei Wada, Toshihiko Eki, Yutaka Ito, Yuu Hirose, Masaki Mishima
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118(20) 号: 20
  • DOI: 10.1073/pnas.2024583118
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Multi-state structure determination and dynamics analysis reveals a new ubiquitin-recognition mechanism in yeast ubiquitin C-terminal hydrolase (2021)
  • 著者名/発表者名: Okada, M., Tateishia, Y., Nojiri, E., Mikawa, T., Rajesh, S., Ogasa, H., Ueda, T., Yagi, H., Kohno, T., Kigawa, T., Shimada, I., Guentert, P., Ito, Y., & Ikeya, T.
  • 雑誌名: biorxiv 巻: 2021.04.22.440356 ページ: 1-39
  • DOI: 10.1101/2021.04.22.440356
  • オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] High‐Efficient and Dosage‐Controllable Intracellular Cargo Delivery through Electrochemical Metal?Organic Hybrid Nanogates (2021)
  • 著者名/発表者名: Zhang Bowen、Zheng Dinuo、Yiming Shi、Oyama Kazuhiro、Ito Masahiro、Ikari Masaomi、Kigawa Takanori、Mikawa Tsutomu、Miyake Takeo
  • 雑誌名: Small Science 巻: 1 号: 12 ページ: 2100069-2100069
  • DOI: 10.1002/smsc.202100069
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] NMR studies of multi-domain adaptor proteins in signal transduction pathways (2024)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Ito，Teppei Ikeya，Sayeesh P.M.，Mao Oide，Yuji Sugita, Hiroshima
  • 学会等名: TJ2024 (Taiwan-Japan NMR Symposium 2024)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] In-cell NMRを用いたKeap1-Nrf2系の解析 (2024)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 隆
  • 学会等名: NMRシンポジウム―環境応答の構造生物学
  • 招待講演
• [学会発表] In-cell NMR studies of the Keap1-Nrf2 system (2023)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Ito，Mei Toyoda，Shiori Suehiro，Kaito Shima，Teppei Ikeya，Takafumi Suzuki，Masayuki Yamamoto，Kohsuke Inomata
  • 学会等名: Asia-Pacific Nuclear Magnetic Resonance (APNMR) 2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 多次元NMRの原理 (2023)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 隆
  • 学会等名: 2023年度?本分光学会主催秋期セミナー「NMR分光法の基礎と応用」
  • 招待講演
• [学会発表] Analysis of the mechanism underlying multivalent interactions between GRB2 and SOS1 and their LLPS using solution NMR (2023)
  • 著者名/発表者名: Teppei Ikeya，Mao Oide，W. Ren，Keita Tateno，Takami Ando，Haruka Sugasawa，Yuji Sugita，Yutaka Ito
  • 学会等名: 日本生物物理学会第61回年会
• [学会発表] GRB2とSOS1による多価相互作用と液液相分離の溶液NMR解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 池谷鉄兵，菅澤はるか，富樫直之，林 俊文，美川 務，杉田有治，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] In-cell NMRにおける細胞試料管理 (2023)
  • 著者名/発表者名: 猪股晃介，豊田芽生，島 海翔，長峰萌華，末広志織，池谷鉄兵，鈴木隆史，山本雅之，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] Interaction of N-and C-terminal SH3 domains of Drosophila adapter protein Drk with Sos and Dos (2023)
  • 著者名/発表者名: Sayeesh PM，Mayuki Iguchi，Haruka Sugasawa，Kahsuke Inomata，Teppei Ikeya，Yutaka Ito
  • 学会等名: The 19th European Magnetic Resonance Congress
  • 国際学会
• [学会発表] In-cell NMRを用いたlinear diubiquitinの細胞内での立体構造解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 屋部祥大，田岸亮馬，鴨志田一，美川 務，猪股晃介，池谷鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] 異種核多次元NMRによる根粒菌マルチドメイン蛋白質FixJの立体構造解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大久保里佳，堀川皓央，伊藤かおり，菱倉直樹，渡邉吏輝，三島正規，猪股晃介，小手石泰康，澤井仁美，城 宣嗣，池谷鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] Structural and dynamic studies on the Drosophila adapter Protein Drk” NMR討論会，横須賀，2023年11月7日 (2023)
  • 著者名/発表者名: Sayeesh PM，Mayumi Iguchi，Teppei Ikeya，Yutaka Ito
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] ストレス応答型の転写制御に関与するKeap1-Nrf2複合体のIn-cell NMR解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 豊田芽生，猪股晃介，末広志織，島 海翔，長峰萌華，池谷鉄兵，鈴木隆史，山本雅之，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] 溶液NMRによるKRASとRGL2の相互作用の解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 助川咲良，富樫直之，P.M. Sayeesh，菅澤はるか，猪股晃介，田仲加代子，伊藤 隆，池谷鉄兵
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] NMRピークの線形解析を用いたKRAS/RGL2RBD滴定データの定量化 (2023)
  • 著者名/発表者名: 富樫直之，助川咲良，菅澤はるか，美川 務，猪股晃介，田仲加代子，伊藤 隆，池谷鉄兵
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] Drk蛋白質のN末端およびC末端SH3ドメインとSos/Dos由来ペプチドとの相互作用解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 井口真由美，P.M. Sayeesh，池谷鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] 溶液NMRによるUbiquitin C-terminal Hydrolase L3 (UCHL3)の構造・ダイナミクス解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 宮田裕貴，菅澤はるか，猪股晃介，伊藤 隆，池谷鉄兵
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] GRB2とSOS1による多価相互作用の溶液NMR解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 林 俊文，館野桂太，菅澤はるか，池谷鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] 蛋白質の立体構造に対する分子クラウディングの影響の解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 加藤聖人，Sayeesh PM，池谷鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] NMRによるFixL-FixJ二成分シグナル伝達系の機能解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 菱倉直樹，渡邉吏輝，大久保里佳，堀川皓央，伊藤かおり，三島正規，猪股晃介，小手石泰康，澤井仁美，城 宣嗣，池谷鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第62回NMR討論会
• [学会発表] Protein structure determination by NMR: conformational multiplicity and the effects of macromolecular crowding (2022)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Ito
  • 学会等名: The 7th International Symposium on Drug Discovery and Design by NMR
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Solution NMR approaches to 3D structure determination of proteins in living cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Ito
  • 学会等名: The Protein Society Webinar “Exploring Proteins in Living Cells”
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 常磁性ランタノイド金属を用いた蛋白質の溶液NMRおよびin-cell NMR解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 隆
  • 学会等名: 第1回生命金属科学シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] Protein behaviours under intracellular crowding environments (2022)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Ito
  • 学会等名: TMU Workshop on Protein NMR
  • 招待講演
• [学会発表] シアノバクテリアの光センサーにおける脱プロトン化した塩基性アミノ酸の観測 (2022)
  • 著者名/発表者名: 永江 峰幸，飯塚 佑介，青山 洋史，宮ノ入 洋平，神野 智司，伊藤 隆，広瀬 侑，三島 正規
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] NMR解析を用いた解糖系酵素PGKの環境適応的活性制御による解糖系調節機構 (2022)
  • 著者名/発表者名: 八木 宏昌，葛西 卓磨，Elisa Rioual，池谷 鉄兵，木川 隆則
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] NMR studies of a Drosophila adapter protein, Drk (2022)
  • 著者名/発表者名: Sayeesh, PM, Teppei Ikeya, Haruka Sugasawa, Riki Watanabe, Yutaka Ito
  • 学会等名: 第1回生命金属科学シンポジウム
• [学会発表] In-cell NMRによるlinear diubiquitinのin-situ立体構造解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 屋部 祥大，田岸 亮馬，鴨志田 一，美川 務，猪股 晃介，池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] In-cell NMR によるKeap1/Nrf2系の研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 豊田 芽生，猪股 晃介，末広 志織，島 海翔，池谷 鉄兵，鈴木 隆史，山本 雅之，伊藤 隆
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] 常磁性 NMR を用いた根粒菌マルチドメイン蛋白質FixJの立体構造解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 大久保 里佳，池谷 鉄兵，渡邉 吏輝，菱倉 直樹，三島 正規，猪股 晃介，小手石 泰康，澤井 仁美，城 宣嗣，伊藤 隆
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] マルチドメイン蛋白質GRB2とSOS1-PRM領域の相互作用解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 館野 桂太，菅澤 はるか，安藤 考史，田端 真彩子，美川 務，猪股 晃介，甲斐荘 正恒，三島 正規，杉田 有治，池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] 常磁性NMRを用いたマルチドメイン蛋白質GRB2の立体構造解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 安藤 考史，菅澤 はるか，館野 桂太，田端 真彩子，美川 務，宮野入 洋平，川端 庸平，Hisham Dokainish，Weitong Ren，大出 真央，寺内 勉，猪股 晃介，三島 正規，甲斐荘 正恒，杉田 有治，池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] GMPPNP結合型K-RasG12VとRgl2RBDの相互作用解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 富樫 直之，宮田 裕貴，亀井 駿，菅澤 はるか，美川 務，猪股 晃介，田仲 加代子，伊藤 隆，池谷 鉄兵
  • 学会等名: 第61回NMR討論会
• [学会発表] Solution NMR approaches to 3D structure determination of proteins in living eukaryotic cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Ito, Kohsuke Inomata, Teppei Ikeya
  • 学会等名: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference (ISMAR)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 複数の異なる NMR データの統合解析によるタンパク質 multi-state 立体構造解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • 学会等名: 第21回日本蛋白質科学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Multi-state structure determination and dynamics analysis reveals a new ubiquitin-recognition mechanism in yeast ubiquitin C-terminal hydrolase (2021)
  • 著者名/発表者名: Teppei Ikeya, Mayu Okada, Yutaka Tateishi, Eri Nojiri, Tsutomu Mikawa, Sundaresan Rajesh, Hiroki Ogasa, Takumi Ueda, Hiromasa Yagi, Toshiyuki Kohno, Takanori Kigawa, Ichio Shimada, Peter G?ntert, Yutaka Ito
  • 学会等名: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference (ISMAR)
  • 国際学会
• [学会発表] Insight into the C-terminal SH3 mediated binding of Drosophila Drk towards Sos and Dos (2021)
  • 著者名/発表者名: Sayeesh. P. M., Teppei Ikeya, Haruka Sugasawa, Riki Watanabe, Yutaka Ito
  • 学会等名: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference (ISMAR)
  • 国際学会
• [学会発表] Insight into the C-terminal SH3 mediated binding of Drosophila Drk towards Sos and Dos (2021)
  • 著者名/発表者名: Sayeesh. P. M., Teppei Ikeya, Haruka Sugasawa, Riki Watanabe, Yutaka Ito
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会
• [学会発表] NMRによるKRASとRGL2の相互作用解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 富樫直之，亀井駿，菅澤はるか，猪股晃介，伊藤隆，田仲加代子，池谷鉄兵
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会
• [学会発表] 直鎖状ユビキチン二量体の溶液構造解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 屋部 祥大，田岸亮馬，鴨志田一，美川務，猪股晃介，池谷鉄兵，伊藤隆第44回日本分子生物学会2021202100
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会
• [学会発表] In-cell NMRを用いたKeap1-Nrf2制御系の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 末広志織，猪股晃介，豊田芽生，池谷鉄兵，鈴木隆史，山本 雅之，伊藤隆第44回日本分子生物学会2021202100
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会
• [学会発表] 液-液相分離による酵素活性の制御機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: 美川 務
  • 学会等名: 第94回日本生化学会大会
• [学会発表] 液-液相分離による酵素反応の活性化とその応用展開 (2021)
  • 著者名/発表者名: 美川 務
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会
• [図書] Integrated Structural Biology - Chapter 5: In-cell Structural Biology Through the Integration of Solution NMR Spectroscopy and Computational Science (2023)
  • 著者名/発表者名: Y. Ito, T. Ikeya, K. Inomata
  • 総ページ数: 404
  • 出版者: Royal Society of Chemistry
  • ISBN: 9781839161834